【原】你知道吗？很多eccDNA研究都是参考这篇文章

eccDNA早在20世纪60年代就被报道，但2015年才开始在全基因组水平上进行研究。2015年6月，Moller等在PANS发表了关于酵母eccDNA的研究，该文章在酿酒酵母（S. cerevisiae）全基因组上共发现1756个eccDNA（图1），这些eccDNA分布在不同位点上，覆盖基因组的23%，包括核糖体基因、转座子残体和一连串的重复基因(HXT6/7、ENA1/2/5和CUP1-1/ 2)等，eccDNA的长度在1~38 kb之间，并且80%的eccDNAs包含自主复制起始位点。根据酿酒酵母eccDNA在其基因组上分布的丰富性和普遍性，推断真核基因组中eccDNA很可能与癌症和其他人类遗传疾病中的CNV有关，另外eccDNA还可以通过复制、删除和分化推动进化过程。

图1 eccDNA在酵母基因组上的分布

这篇文章不仅首次在全基因组水平上报道了eccDNA特性和功能，同时还提供了在全基因组水平上研究eccDNA的方法，后续的很多eccDNA-seq都源自此文章，下面就为大家解析此方法。

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原理

本文开发的Circle-Seq，是基于质粒提取、酶切消化和高通量测序的技术，根据线性DNA和环状DNA结构和化学性质上的差异，将裂解的细胞通过柱纯化、消除线性DNA和滚环扩增三个主要步骤富集eccDNA，结合高通量测序获取eccDNA的信息（图2）。

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具体实验步骤

1、用玻璃微珠涡旋裂解酵母细胞，采用质粒提取试剂盒(Plasmid Mini AX；A&A Biotechnology)，将细胞裂解液通过离子交换膜柱初步分离出环状DNA。为了验证实验的可靠性，文章将pBR322、pUC19、pUG72三种外源质粒作为spik in，分别按照：1:1、1:50、1:2,500的比例加入到细胞裂解液中，一起进行后续的操作。

2、使用限制性内切酶NotI 37℃处理17 h，把线粒体DNA线性化，并且把大的线性染色体DNA切断。用DNA外切酶消化线性DNA，获取纯的环状DNA；

3、采用ϕ29DNA聚合酶滚换扩增eccDNA；

4、超声打断处理后构建二代测序文库并进行测序。

图2  Circle-Seq实验流程示意图

为了说明实验效果，文章中有一系列的质控：

质控1

三种外源质粒pBR322、pUC19、pUG72按照：1:1、1:50、1:2,500(plasmid:cell) 作为spik in加入细胞裂解液中，通过检测已知质粒验证Circle-Seq技术的有效性；

图3 外源质粒（已知环状DNA元件） 

质控2

使用限制性内切酶NotI处理样本后，再利用外切酶消化线性DNA，富集eccDNA，并通过内参基因ACT1的定量PCR验证线性DNA的消除效率；

图4 核酶外切酶对线性DNA的消除效率

eccDNA鉴定

从mapping到基因组的数据中筛选reads连续覆盖大于1kb的基因组区域，并且该区域内测序深度显著高于其他基因组区域，该处被认为存在eccDNA的区域（图6上）；然后通过分析Junction Read（将一条read平均切割成三段，首尾不能同时mapping到参考基因组上的read）进一步鉴定eccDNA（图6下）。

图6 生信分析鉴别eccDNA

      除此之外，作者还单独发表了详细的protocl和视频，供研究人员参考和学习。

Protocol链接：http://www./video/54239

参考文献：

[1] Andrew R. Morton et al., (2019), Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications, Cell, DOI: https:///10.1016/j.cell.2019.10.039

[2] Wu, S., Turner, K.M., Nguyen, N. et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1763-5

[3] Koche, R.P., Rodriguez-Fos, E., Helmsauer, K. et al. Extrachromosomal circular DNA drives oncogenic genome remodeling in neuroblastoma. Nat Genet (2019) doi:10.1038/s41588-019-0547-z