黄芪和当归的主要活性成分配伍促进衰老造血干细胞增殖作用的研究

血细胞的生成是多能造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）在特定造血微环境的网络调控下，增殖分化成各种成熟血细胞的动态平衡过程。人类HSCs主要存在于骨髓内，外周血中也含有少量的HSCs。HSCs具有高度自我更新和增殖的能力，可以分化成各种血细胞的前体细胞（如造血祖细胞），然后在造血微环境的作用下再定

黄芪和当归的配伍应用最有名的是由李东垣所创的黄芪、当归配比为5∶1的当归补血汤，由黄芪一两、当归二钱组成，主治气虚发热之证。现代以当归补血汤治疗多种贫血和造血功能低下有较好疗效。以往研究表明，黄芪和当归配伍可增加骨髓有核细胞数和血中造血生长因子（HGF）水平，抑制HSCs衰老和促进其增殖^[4-5]，升高外周血像^[6-7]，其中以黄芪和当归1∶1配伍的促造血作用最强。进一步以HSCs衰老模型研究发现，黄芪-当归1∶1配伍可促进衰老HSCs增殖，促进细胞周期转换^[8]。唐蓉等^[9]研究表明，黄芪-当归1∶1配伍时由小肠吸收的主要成分是阿魏酸、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和芒柄花素5种活性成分。由于中药多是通过口服给药吸收后进入体内发挥作用，因此，推测此5种活性成分可能为其促造血作用的主要药效物质。但是，这5种成分配伍能否发挥黄芪、当归配伍时的功效，其促造血的作用机制是什么，这些问题尚未阐明。本实验采用HSCs衰老模型，研究黄芪和当归的主要活性成分配伍对衰老HSCs增殖的影响，以明确其促造血作用的主要药效物质，为其合理应用提供科学依据。

1  材料

1.1  实验动物

C57BL/6小鼠，6～8周龄，雄性，体质量20～25 g，动物质量合格证号SCXK（湘）2016-0002；清洁级SD雄性大鼠，体质量180～220 g，动物质量合格证号SYXK（湘）2016-0002；动物均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验场地湖南中医药大学动物实验中心［场地许可证号SYXK（湘）2013-0005］。

1.2  主要试剂

优级胎牛血清（批号P30-2602）、IMDM培养液（批号12440046），美国Hyclone公司；二甲亚砜（DMSO，批号ST038）、三丁基过氧化氢（T-BHP，批号STBD5969V，用时以含0.1% DMSO-IMDM培养液溶解）、青链霉素混合液（批号SV30010），美国Sigma公司；β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色试剂盒（碧云天生物有限公司，批号CO602）；细胞增殖及MS分选柱（批号130-042-201），德国Miltenyi公司；磷酸盐缓冲液（PBS，吉诺生物医药技术有限公司，批号GNM20012）；牛血清白蛋白（BSA，批号WB07012）、乙二胺四乙酸（EDTA，批号WB07014），长沙维尔生物科技有限公司；Ficoll淋巴细胞分离液（天津灏洋华科生物科技有限公司，批号TBD2013LR）；大鼠抗小鼠β-actin单克隆抗体（批号60008-1-Ig）、兔抗小鼠细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）单克隆抗体（批号04-1151）、兔抗小鼠细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）单克隆抗体（批号ab199728）、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗（批号ab205718）、HRP标记羊抗鼠二抗（批号ab205719），Abcom公司。

1.3  实验药物

黄芪甲苷（批号16022804）、毛蕊异黄酮（批号16031110）、毛蕊异黄酮苷（批号16031205）、芒柄花素（批号16031005）、阿魏酸（批号rq0838），质量分数≥98%，均购于上海吉雅生物科技有限公司；黄芪和当归饮片由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，由湖南中医药大学第一附属医院左亚杰教授鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceusBge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根，产地内蒙古；当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根，产地甘肃。

2  方法

2.1  小鼠骨髓单个核细胞（BMNCs）制备及Sca-1⁺ HSCs分离纯化和鉴定

小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，PBS（含2 mmol/L EDTA、0.5% BSA，pH 7.4）反复冲洗骨髓腔，制备成单细胞悬液，缓缓加入到Ficoll淋巴细胞分离液上方，4 ℃、2 000 r/min离心20 min，吸取中间白膜层至新离心管中，PBS洗涤3次，即得BMNCs。取BMNCs加入90 μL PBS和10 μL Anti-Sca-1-PE抗体标记细胞，4 ℃孵育10 min，800 r/min离心5 min弃上清，加入80 μL PBS和20 μL Anti-PE Micro Beads，4 ℃孵育20 min，800 r/min离心5 min后弃上清，以0.5 mL PBS重悬细胞，加入MS分选柱内，流出道收集未标记细胞（即Sca-1⁻细胞），0.5 mL PBS洗柱3次。阳性细胞会留滞在柱内，其他细胞流出分选柱。取下分选柱，加入0.5 mL PBS冲出标记细胞（即Sca-1⁺ HSCs）。收集Sca-1⁺ HSCs，流式细胞仪检测分选前后Sca-1⁺ HSCs阳性率。分选前BMNCs中Sca-1⁺细胞为3.6%，而分选后Sca-1⁺细胞高达92.39%，表明分选后HSCs纯度大幅度提高。

将洗涤后的HSCs以培养液（含10% BSA的IMDM培养基，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素）调细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种培养瓶内，于37 ℃、5% CO₂孵箱培养。每2天换液1次。

2.2  实验药物的制备

2.2.1  黄芪-当归配伍提取物的制备  设立黄芪-当归1∶1配伍，大鼠黄芪和当归配伍的临床等效剂量为3.8 g/kg，含药血浆制备的给药剂量取临床等效剂量10倍，为38 g/kg。分别称取药材，以水加热回流法提取3次（第1次8倍量水，提取1 h；第2、3次6倍量水，提取1 h），合并3次提取液，滤过，60 ℃真空减压浓缩得浸膏，调药物质量浓度为1.9 g/mL（相当于黄芪生药质量浓度0.95 g/mL，当归生药质量浓度0.95 g/mL）。药液加入0.1%的苯甲酸钠，4 ℃冷藏备用。

2.2.2  含药血浆的制备  参照文献方法^[7]，SD大鼠20只，随机分为2组，每组10只，空白组ig等量双蒸水，黄芪-当归1∶1配伍组ig黄芪-当归配伍提取物38 g/kg（黄芪19 g/kg、当归19 g/kg），每天1次，连续给药7 d，末次给药2 h后腹主动脉取血，以2% EDTA-2Na抗凝，3 000 r/min离心15 min，取上层血浆，即分别为空白血浆和含药血浆，将同组各动物血浆等量混合，分装后−80 ℃保存备用。

2.2.3  各活性成分供试药液制备  黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素以DMSO-PBS溶解，阿魏酸以DMSO-IMDM溶解，制备成储存液，用时以IMDM培养基稀释，培养基中DMSO终体积分数为0.1%。

2.3  CCK-8法检测5种活性成分对衰老HSCs增殖的影响

取传代4～6代的HSCs细胞接种于96孔板中，无血清培养基培养12h使细胞同步化于G₀期后，换成含T-BHP（100 μmol/L）的完全培养基以诱导HSCs衰老，同时加入不同质量浓度的各活性成分，继续培养24 h后，采用CCK-8法检测450 nm处吸光度（A）值，以反映细胞增殖活性，确定可促进HSCs增殖的主要成分。

增殖率＝实验组A值/对照组A值－1

2.4  主要活性成分与其他活性成分配伍抗HSCs衰老和促细胞增殖实验

在“2.3”项确定具有促HSCs增殖作用的主要活性成分（阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素）后，以此3个成分为基础因子，采用L₄(2³)正交试验研究主要成分（基础因子）与毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷配伍对衰老HSCs增殖和衰老的影响，分析各成分配伍对HSCs增殖和衰老是否有增效作用。正交试验设计方案见表1。取4～6代HSCs接种于96孔培养板，无血清培养液培养12 h使细胞同步于G₀期。然后换含T-BHP的完全培养基，同时加入不同活性成分，继续培养24 h后，同前以CCK-8法测定细胞增殖率。同时将细胞进行SA-β-Gal染色，倒置显微镜下计数400个细胞，计数阳性细胞，阳性细胞胞质呈蓝色，阴性细胞不着色。计算阳性细胞（即衰老细胞）率。

衰老细胞率＝阳性细胞数/细胞总数

 

2.5  各活性成分、活性成分配伍及黄芪-当归1∶1配伍抗HSCs衰老和促增殖实验

在“2.4”项实验确定具有促HSCs增殖和抗衰老作用的活性成分配伍后，设立对照组、模型组、空白血浆组（10%空白血浆）、阿魏酸组（9 μg/mL）、黄芪甲苷组（8 μg/mL）、芒柄花素组（6 μg/mL）、毛蕊异黄酮组（10 μg/mL）、毛蕊异黄酮苷组（10 μg/mL）、活性成分配伍组（阿魏酸9 μg/mL＋黄芪甲苷8 μg/mL＋芒柄花素6 μg/mL＋毛蕊异黄酮10 μg/mL＋毛蕊异黄酮苷10 μg/mL）、黄芪-当归1∶1含药血浆组（10%黄芪-当归1∶1配伍含药血浆）。取4～6代HSCs接种于96孔培养板，无血清培养液培养12 h使细胞同步于G₀期。然后对照组加入完全培养液；模型组加入等量含T-BHP的完全培养液；空白血浆对照组加入10%空白血浆和含T-BHP的完全培养液；不同活性成分或活性成分配伍组加入不同活性成分或其配伍组方和含T-BHP的完全培养液；黄芪-当归1∶1含药血浆组加入10%含药血浆和含T-BHP的完全培养液。继续培养24 h后，同前测定细胞增殖率和衰老细胞率。

2.6  细胞周期测定

运用流式细胞分选术测定细胞周期。分组和处理同“2.5”项，离心收集各组细胞1×10⁶个，加1 mL PBS洗涤1次，70%冰乙醇固定过夜，加入100μL牛胰核糖核酸酶（1 g/L）37 ℃孵育30 min。然后加入碘化丙啶（PI）1 mL（用0.01 mol/L PBS配成终质量浓度50 μg/mL的PI工作液），4 ℃避光染色30 min，测定样本细胞数不少于2×10⁵个。流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布，计数G₀期、G₁期、G₂期、S期、M期细胞百分率。以G₀期和G₁期细胞作为静止期细胞，G₂期、S期和M期为增殖期细胞。

2.7  Western blotting法测定Cyclin D1和CDK4蛋白表达

细胞处理同“2.5”项。收集各组细胞，以PBS洗涤，以总蛋白提取试剂提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，将各样品蛋白浓度调整一致，加入适量5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min，冷却后加入加样孔。然后进行SDS-PAGE电泳，电转法转膜。将转膜后的PVDF膜以封闭液封闭，再加入用TBST（含5%脱脂奶粉）稀释的β-actin一抗（1∶5 000）、Cyclin D1一抗（1∶10 000）、CDK4一抗（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗3次，加入TBST稀释的HRP标记的羊抗兔二抗（1∶6 000，用于CDK4、Cyclin D1测定）或HRP标记的兔抗鼠二抗（1∶5 000，用于β-actin测定），室温孵育30 min，TBST洗4次。以ECL化学发光试剂进行显色。AlPhaEaseFC图像处理系统分析目标条带的累积吸光度值。以目的蛋白与β-actin累积吸光度值比值作为蛋白相对表达量。

2.8  统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验结果以表示。多组间比较采用单因素方差分析。组间两两比较，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett’sT3检验。L₄(2³)正交试验采用正交试验的方差分析，明确基础因子与次要因子之间是否有相互作用。

3  结果

3.1  5种活性成分对衰老HSCs增殖的影响

以模型组（T-BHP 100 μmol/L）为对照（增殖率为0），不同质量浓度阿魏酸、黄芪甲苷和芒柄花素可显著促进衰老HSCs增殖，其中阿魏酸在2.25～18.00 μg/mL、黄芪甲苷在2～16 μg/mL、芒柄花素在1.5～12.0 μg/mL时促细胞增殖活性的作用呈量效关系。而毛蕊异黄酮在2.5～40.0 μg/mL、毛蕊异黄酮苷在1.25～20.00 μg/mL时对衰老HSCs的促增殖作用不超过10%，表明毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷在此质量浓度下对衰老HSCs无显著的促增殖作用，阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素为黄芪、当归配伍促HSCs增殖的主要有效成分。结果见图1。

3.2  主要成分和次要成分配伍对衰老HSCs增殖和衰老的影响

在确定了5种成分中的主要成分后，取对细胞具有显著促增殖作用的药物质量浓度［约为药物促细胞增殖实验的半数有效浓度（EC₅₀）］为有效浓度，即阿魏酸为9 μg/mL，黄芪甲苷为8 μg/mL，芒柄花素为6 μg/mL，以此3种成分为基础因子，毛蕊异黄酮（10 μg/mL）和毛蕊异黄酮苷（10 μg/mL）为次要因子，进行L₄(2³) 正交试验。结果表明，3个主要活性成分配伍（基础因子）可显著促进HSCs增殖和降低细胞衰老率（P＜0.05）。基础因子＋毛蕊异黄酮和基础因子＋毛蕊异黄酮苷促HSCs增殖和降低细胞衰老率的作用强于基础因子（P＜0.05）。基础因子＋毛蕊异黄酮＋毛蕊异黄酮苷促细胞增殖和降低细胞衰老率的作用强于基础因子、基础因子＋毛蕊异黄酮和基础因子＋毛蕊异黄酮苷（P＜0.05），结果见表2。交互作用分析表明，毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷与基础因子配伍具有增效作用，表明主要成分阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素与次要成分毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷配伍对促HSCs增殖和抑制细胞衰老具有增效作用。

3.3  单配伍含药血浆对HSCs增殖率和衰老率的影响

与模型组或空白血浆组比较，阿魏酸组、黄芪甲苷组、芒柄花素组、活性成分配伍组、含药血浆组均可促进HSCs增殖，降低细胞衰老率（P＜0.05）；而毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷无显著的促HSCs增殖和降低细胞衰老率的作用（P＞0.05）。活性成分配伍组促HSCs增殖和降低细胞衰老率的作用强于5个活性成分单用（P＜0.05）。含药血浆组和活性成分配伍组促HSCs增殖和降低细胞衰老率的作用比较差异无显著性意义（P＞0.05）。结果见表3和图2。

3.4  单个活性成分、活性成分配伍与黄芪-当归1∶1配伍含药血浆对衰老HSCs细胞周期的影响

与对照组比较，模型组和空白血浆组G₀/G₁期细胞显著增多（P＜0.01），G₂/M＋S期细胞显著减少（P＜0.01）。与模型组或空白血浆组比较，阿魏酸组、黄芪甲苷组、芒柄花素组、活性成分配伍组和含药血浆组G₀/G₁期细胞显著减少（P＜0.01），G₂/M＋S期细胞显著增加（P＜0.01）。与活性成分配伍组比较，阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷组G₀/G₁期细胞增多（P＜0.05），G₂/M＋S期细胞减少（P＜0.05），而含药血浆组与活性成分配伍组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表4。

3.5  单个活性成分、活性成分配伍与芪归1∶1配伍含药血浆对Cyclin D1、CDK4蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组和空白血浆组Cyclin D1和CDK4蛋白表达显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，阿魏酸组、芒柄花素组、黄芪甲苷组、活性成分配伍组Cyclin D1和CDK4蛋白表达显著增加（P＜0.05）。与活性成分配伍组比较，阿魏酸组、黄芪甲苷组、芒柄花素组、毛蕊异黄酮组和毛蕊异黄酮苷组Cyclin D1和CDK4蛋白表达均显著降低（P＜0.05、0.01）。与空白血浆组比较，含药血浆组Cyclin D1和CDK4蛋白表达均显著增加（P＜0.05）。结果见表5和图3。

4  讨论

HSCs是机体造血系统的种子细胞，具有很强的多向分化和自我更新潜能^[1]。HSCs及祖细胞增殖、分化是血细胞正常发育成熟、维持正常造血功 

能的基础。机体衰老或者在放疗、化疗条件下均会引起HSCs老化，HSCs老化的显著特征是自我更新和增殖能力降低，表现为衰老的HSCs向骨髓归巢能力下降，自我更新能力减弱和分化功能异常，细胞增殖周期阻滞，出现明显延迟的增殖反应，从而表现出贫血、免疫功能衰退等造血系统衰老的特征性表现和肿瘤发生率增加、组织器官损伤难以修复等^[10-11]。化疗、放疗和活性氧类（ROS）等多种因素是引起HSCs衰老和细胞周期停滞的重要原因。目前认为，HSCs老化的产生与多种机制有关，其中p53/p21信号通路发挥了重要的作用。在应激条件下（如DNA损伤、缺氧和感染等）激活p53，导致p21高表达，p21能抑制细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）激活，引起细胞周期停止；上调p14 ARF或nutlin-3引起p53激活和p21高表达可导致细胞老化^[12]。SA-β-Gal染色是鉴定细胞衰老的重要方法，且该方法仅会染色衰老细胞，而衰老前细胞、静止期细胞以及肿瘤细胞都不会着色，其实验结果较可靠，不易被其他杂系细胞所干扰^[13]。

以往采用血浆药理学方法，研究了黄芪、当归配伍对衰老HSCs增殖的影响，结果表明，10%的黄芪-当归配伍含药血浆可显著促进HSCs增殖，而且以黄芪-当归1∶1配伍的作用较强，其机制与调节细胞周期有关^[8]。大鼠肠吸收实验研究表明^[9]，黄芪-当归1∶1时肠吸收主要成分是阿魏酸、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和芒柄花素5种活性成分。因此，在本实验中，为进一步比较有效成分配伍是否具有黄芪-当归1∶1配伍相似的促HSCs增殖的作用，设立了黄芪-当归1∶1配伍含药血浆，并与空白血浆进行比较，探讨含药血浆和有效成分配伍作用的异同。

本实验结果表明，黄芪、当归活性成分阿魏酸、黄芪甲苷和芒柄花素可呈剂量依赖性地促进衰老HSCs增殖和延缓HSCs衰老，为黄芪、当归抗HSCs衰老和促进细胞增殖的主要活性成分。而毛蕊异黄酮在2.5～40.0 μg/mL、毛蕊异黄酮苷在1.25～20.00 μg/mL时对衰老HSCs无显著促增殖和降低细胞衰老率的作用。但正交试验研究表明，毛蕊异黄酮或毛蕊异黄酮苷与阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素联合使用时，可显著促进衰老的HSCs增殖，降低细胞衰老率。表明毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷单独应用虽无促HSCs增殖和降低细胞衰老的作用，但与3个主要有效成分配伍后可增强主要活性成分促细胞增殖和降低细胞衰老的作用，5种成分配伍后对促进细胞增殖和抑制细胞衰老具有增效的作用。

在细胞周期中，细胞周期G₁期是细胞衰老的关键期间，也是对其衰老控制的关键控制点。因此，通过对G₁期进行调控，可改善细胞衰老。CDK4是细胞周期调控的核心^[14]，Cyclin D1为正性调节因子，细胞周期依赖性激酶抑制物（CKI）为负性调节因子^[15]。P16是CKI家族中的调节因子，在G₁期关键控制点发挥重要作用，其机制是能与CDK4进行特异性结合，阻止Cyclin D1/CDK4复合物的形成，导致Rb蛋白磷酸化水平降低，使细胞不可逆的停滞于G₁期。Cyclin是调控细胞周期的重要因素之一，它作用于细胞周期的不同阶段，引起细胞分裂、增殖，加速细胞周期进程。在Cyclin家族中，Cyclin D在细胞G₁/S转换点中发挥着重要的作用，其中Cyclin D1是G₁期的特异性表达蛋白，通过加速G₁期的进程而缩短细胞周期^[16]。CDK处于细胞周期调控网络中的中心地位，受细胞周期蛋白影响，CDK主要是通过与周期蛋白结合而正向调节细胞周期进程。不同的Cyclin识别并结合不同的CDK，组成不同的Cyclin-CDK复合体，其中CDK4与Cyclin D1结合，可通过将Rb蛋白磷酸化而使Rb蛋白失去对细胞周期的阻滞作用，从而实现对细胞周期的推动和转化。本实验结果表明，与对照组比较，模型组和空白血浆组静止期（G₀/G₁期）细胞显著增多，增殖期（G₂/M＋S期）细胞显著减少，CyclinD1和CDK4蛋白表达显著降低。表明HSCsS期细胞显著增加，Cyclin D1和CDK4蛋白表达显著增强。与空白血浆组比较，黄芪-当归1∶1配伍含药血浆组的G₀/G₁期细胞也显著减少，G₂/M＋S期细胞显著增加，CyclinD1和CDK4蛋白表达显著增加。与活性成分配伍组比较，各活性成分单用组的G₀/G₁期细胞增多，G₂/M＋S期细胞减少，Cyclin D1和CDK4蛋白表达均显著降低。而含药血浆组与活性成分配伍组比较无显著差异。表明阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素为黄芪当归配伍促HSCs增殖的主要药效物质，而次要成分毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷与主要成分配伍后可增强五种成分配伍后促HSCs增殖的作用，黄芪当归1∶1配伍与5种活性成分配伍具有相同的促HSCs增殖的作用。这些结果说明，主要成分阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素和主要成分与次要成分毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷配伍，以及黄芪、当归配伍均能增加Cyclin D1和CDK4表达，从而促进了CyclinD1/CDK4复合物的形成，促进了HSCs由G₁期进入S期，实现对细胞周期的推动和转化。

本研究结果表明，黄芪和当归1∶1配伍和其5种主要活性成分阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷配伍均可改善HSCs衰老，缩短细胞周期，促进HSCs增殖。5种活性成分配伍具有增效作用。这可能是不同活性成分作用于HSCs增殖的不同环节，从而发挥增效作用。

来  源：朱嘉欢，黄小平，邓常清. 黄芪和当归的主要活性成分配伍促进衰老造血干细胞增殖作用的研究 [J]. 中草药, 2019, 50(1):111-119.