【原】上清可溶性表达重组蛋白的纯化

friendbio 2020-07-15

展开全文

重组蛋白以上清可溶性状态表达，细菌破碎裂解以后可以通过其融合标签进行特异性纯化，目前常用的标签纯化方法有6His标签亲和纯化，GST标签亲和纯化（谷胱甘肽），MBP标签亲和纯化和Strep II标签蛋白亲和纯化等，这些纯化方法都已经非常成熟，Frdbio针对不同实验需求开发出多款产品，实验人员可参照操作说明进行。需要强调的是，由于蛋白质自身理化性质不同，因此在纯化过程中所遇到的问题也不尽相同，最为突出的问题就是标签蛋白不挂柱（或不易洗脱）和纯化蛋白杂带多；并不是按照标准说明就可以得到高纯蛋白的；遇到这些问题除了求助于厂家的技术支持外，还需要:

1)仔细排除实验种操作失误以及不合格试剂带来的影响，

2)在此基础上进一步优化纯化条件，比如如果纯化蛋白杂带多可以尝试不同条件和不同洗脱浓度的梯度洗脱，收集不同的组分以找到最优的纯化条件；具体内容可参照后半部分His和GST标签蛋白纯化问题分析与解决内容

3)尝试不同的纯化介质，比如：如果Ni-NTA纯化杂带太多可以尝试Co –NTA或Zn-NTA。

1.SOP Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白

1）样品制备

样品制备1: 细菌或酵母胞内表达的蛋白

（1）将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中，８,000rpm，离心15min收集菌体，然后加入1/10体积的裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，10 mM imidazole ，pH 8.0，1mM PMSF) ，加入0.2-0.4mg/ml溶菌酶。

PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。

（2）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

（3）将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm下，4℃离心20～30分钟，取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

样品制备２：酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

将诱导表达结束的培养物转移到离心管中，８,000rpm，离心15min，收集上清。