【原】Ni-NTA 镍柱纯化操作说明（中文）

      本文是本实验室所用的NI-NTA镍柱使用说明书（生工生物工程），该镍柱使用效果较好，说明书中操作方法较为详细，方便大家使用和查阅附于此，如有侵权请联系删除

产品编号：C600791/C600792/C600793/C600332

C600791 包装规格： 1 mL (5/10 columns)（重力型预装柱）

C600792 包装规格: 1X1 mL/ 5X1 mL/ 1X5 mL/ 5X5 mL(适配各类中压色谱系统，如 ÄKTA  等)

C600793 包装规格： 5 mL (1/5/10 columns)（重力型预装柱）

C600332 包装规格： 1 Kit (1 mL X 10 columns+500mL Elution Buffer+500mL Binding/Wash Buffer)

产品简介:

Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂是以6%交联的琼脂糖为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸（NTA）螯合镍离子（Ni2+ ） 后的产品， 更加稳定，可以纯化组氨酸标签的蛋白。 Ni-NTA  树脂可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、 昆虫细胞和 哺乳动物细胞）的组氨酸标签蛋白的纯化。 在含组氨酸标签的重组蛋白表达后，可以利用变性或非变性条件对目的蛋白进行 纯化。 已经连接到树脂上的蛋白可以用低pH溶液、咪唑溶液洗脱。

特征参数:

平均粒径	90 μm
蛋白结合能力	约 10-40 mg  组氨酸标签蛋白/1mL  树脂
使用过程中兼容性	所有常用的缓冲液、变性剂和去污剂中稳定
在溶液中避免有	螯合剂, 例如 EDTA，EGTA，柠檬酸，组氨酸等。
酸碱稳定性	短期（2 h）pH 2~14
储存缓冲液	20%乙醇
储存温度	4~8。C  不可冻存

C600792 产品信息：

C600792	Ni-NTA 纯化树脂预装柱（中压）
规格	1 mL	5 mL
基质	6%高度交联琼脂糖凝胶
蛋白结合能力	约 10-40 mg  组氨酸标签蛋白/1mL  树脂
平均粒径	90 μm
耐压	0.3 MPa, 3 bar
柱子尺寸(内径×高度)	0.7×2.5 cm (1 mL)；1.6×2.5 cm (5 mL)
储存缓冲液	20%  乙醇
储存温度	4~8。C  不可冻存

各试剂与 NI-NTA 树脂的兼容性:

	试剂	浓度
还原剂	DTE	5 mM

	DTT	0.5 -1 mM
	β-mercaptoethanol	20 mM
	TCEP	5 mM
	reduced glutathione	10 mM
变性剂	urea	8 M
	Guanidine-HCl	6 M
去污剂	Tween20	2%
	TritonX-100	2%
	NP-40	2%
	CHAPS	2%
其他添加剂	ethanol	20%
	Glycerol	50%
	Na2SO4	0.1 M
	NaCl	1.5 M
	EDTA	0.2-1 mM
	EGTA	0.2 mM
	citrate	60 mM
溶液	sodium phosphate（PH 7.4）	50 mM
	Tris-HCl（PH 7.4）	0.1 M
	Tris-acetate（PH 7.4）	0.1 M
	HEPES（PH 7.4）	0.1 M
	MOPS（PH 7.4）	0.1 M
	sodium acetate（PH 7.4）	0.1 M

Note:

4  为了有利于纯化，按照下列操作步骤对树脂进行预清洗，同时注意溶液中不能包含还原剂。

4  请在室温下使用树脂。

4  螯合剂应小心使用（而且只能用于样品中， 不能用于纯化Buffer中）。在离心或过滤之前，为了抵消螯合剂对金属离子的脱落，可以稍加MgCl2。

推荐的缓冲液:

非变性条件:

Binding/Wash Buffer （含10 mM  咪唑）：C600303-0500（BBI）

Elution Buffer （含250 mM  咪唑）：C600304-0500（BBI）

变性条件:

Binding/Wash Buffer：20 mM Tris-HCl ，8 M  尿素，500 mM NaCl ，5 mM  咪唑， pH 8.0，

Elution Buffer：20 mM Tris-HCl ，8 M 尿素，500 mM NaCl ，500 mM  咪唑，pH 8.0，

Note: 4  为了获得更多量和更高纯度的蛋白， 需要确定最适咪唑浓度，不同蛋白是不同的。 平衡缓冲液20~40 mM咪唑可适用于 大部分蛋白， 洗脱缓冲液500 mM  咪唑通常能将目的蛋白全部洗脱，建议初次洗脱进行咪唑梯度洗脱，以确定最适咪唑 洗脱浓度。

4  在20 mM咪唑存在下的蛋白上清液可以增加特异性，减少非特异性结合。但是如果在此浓度下标签蛋白不能和树脂结合， 可以适当减少咪唑浓度到5~10 mM或是在刚开始纯化时不加入咪唑。 4  所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。

样品准备

下面的方法已成功应用在我们实验室中， 其他的确定方法也是有效的。

组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌下非变性条件下可溶性表达）

稀释重组表达的：每克大肠杆菌菌体加入5~10 mL Binding Buffer重悬。样品和Binding Buffer含同样浓度的咪唑可以避免宿 主细胞表达的含组氨酸的蛋白。 同时要去除大颗粒和高浓度的螯合剂，如EDTA，组氨酸、 柠檬酸等杂质， 防止破坏Ni-NTA 树脂。

1. 酶解：0.2 mg/mL  溶菌酶，20 μg/mL DNase，1 mM MgCl2 ，1 mM PMSF（终浓度）或其他蛋白酶抑制剂。加入的抑

制剂必须对镍柱没有影响，4。C混匀30 min。

2. 机械裂解：超声，均质， 反复冻融等。

3. 调整裂解液的pH到7.4：不要用强碱或酸调节pH（防止沉淀）。

4. 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4。C 12000 rmp离心20 min，温度的选择取决于蛋白的稳定性。 5.     收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。

6. 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸铵进行蛋白沉淀。用1X  PBS透 析，加入到柱中，如果样品中不含EDTA，组氨酸， 柠檬酸等影响柱子的成分，可以直接上柱。在细胞质表达的试剂盒， 请用其他试剂或试剂盒（C510020昆虫细胞蛋白裂解液，C500022动物细胞蛋白裂解液，C500026酵母蛋白裂解液）或 查阅其他的相关文献。然后将提取的蛋白与5倍量的Binding/Wash Buffer混合。其他的Buffer可以使用， 但要根据经验确 定。

Note: 4  也可以将样品直接上柱（省略以上步骤）。如果直接上柱， 延长机械裂解时间，例如超声 10 min 。样品粘度越高纯化所 需的总时间越长。

组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌中包涵体表达变性条件纯化）

1. 用1X PBS悬浮细胞（每mL细菌沉淀需要约5 mL的1X PBS），按照上面的超声条件进行实验。

2. 裂解液在12,000 rpm离心10 min收集包涵体。用1X PBS洗涤几次包涵体。

3. 用Binding/Wash Buffer溶解包涵体（每mL包涵体需要约5 mL的Binding/Wash Buffer），并在室温下孵育30~60 min。可 能需要均质或超声将沉淀完全溶解。

4. 12,000 rpm离心30 min去除剩余的不溶物。 小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀。

重力法组氨酸标签蛋白纯化步骤:

可根据自身实验情况进行调整，可以在室温或4。C进行纯化。

1. 根据需求载量取一根相应规格Ni-NTA预装柱， 将存储缓冲液通过重力流出。

2. 将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer混匀，使总体积相当于两个柱体积。

3. 用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子。 使用0.5~1 mL/min流速，使缓冲液排出树脂。

4. 将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer 1:1混匀加入柱子或直接上柱。收集流穿液到离心管中。如有多余样品可再次上样， 重新流通一次。

5. 用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复这个步骤，直到流穿液的吸光度 280 nm接近基线。

6. 用两倍柱体积的Elution  Buffer  洗脱柱上的组氨酸标签蛋白。 此步骤重复两次，每次的洗脱液分别保存。直到洗脱液的 吸光度280 nm接近基线。

7. 柱料后处理：用5倍体积Elution Buffer洗脱柱料，再用5倍体积Binding/Wash Buffer平衡柱料，最后用5倍体积ddH2O清 洗柱料，加入20%乙醇保护液，置于2-8。C保存。

8. 通过测量在280 nm吸光度或用考马斯亮蓝蛋白浓度测定试剂盒（C503041）或BCA法蛋白浓度测定试剂盒（C503021）

确定洗脱液中蛋白浓度。洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。

Note: 4  可用凝胶过滤的方法（C500090重力型去盐柱） 或透析去除咪唑。如进行SDS-PAGE，样品中含6 M盐酸胍时必须透析 到8 M尿素中。 4  如想得到更好的纯化效果，请适当延长孵育时间。 4  如果购买的是C600792中压色谱柱， 请根据实际使用仪器的要求进行柱机连接后再进行以上操作。 4   以上柱体积特指柱料体积。 4  填料反复使用建议用于同种蛋白的纯化，以防污染。

在位清洗

在位清洗步骤

存到20%的乙醇中。

树脂再生

再生步骤

常见问题:

问题
流速很慢		如果可能的话。增加超声前细胞浆的稀释度或超声后细胞浆的稀释度。 继续处理直到降低粘度，可额外加入DNase I 和Mg2+ ，过滤或离心样品。 如果液体非常粘稠也连接真空泵加快流速。
	目标蛋白难溶或是在 纯化过程中蛋白产生 了沉淀	添加洗涤剂或其他添加剂，轻轻搅拌30分钟，以帮助溶解的标记蛋白。注意 Triton  X-100 和NP-40（不是Tween）在280 nm有最高吸收峰，另外洗涤剂不易被透析。 包涵体：蛋白质通常可以从包涵体中溶解（变性），常见的变性剂如4~6 M盐酸胍， 4~8 M尿素，或强洗涤剂。轻轻搅拌30 min以上有助于蛋白质的溶解。
组氨酸标签蛋白 量少	组氨酸标签没有被完 全洗脱	再次加入洗脱Buffer进行洗脱。
	在样品流穿液中有组	样品缓冲液中咪唑含量过高，用低浓度咪唑，确保样品中的螯合剂或还原剂浓度。

	氨酸蛋白	组氨酸标签可能没有暴露出来。 用尿素或盐酸胍将包涵体蛋白变性，为防止样品被稀释可加入固体的尿素或盐酸 胍。 组氨酸标签可能已经缺失，检查基因序列。
	组氨酸标签蛋白没有 被洗脱下来	组氨酸标签蛋白仍然在柱子上。 洗脱时用更高浓度的咪唑溶液。 标签蛋白可能在柱子内沉淀。 可减少样品量。 洗脱过程中咪唑浓度变低。 可以尝试用适量非离子去污剂或改变NaCl浓度，或是在变性条件下进行洗脱。非 特异性疏水作用或其他作用。
洗脱出的组氨酸 标签蛋白不纯	在样品和Binding Buffer混合液中，咪唑 浓度太低	在样品和binding buffer混合液中用更高浓度的咪唑浓度。浓度20~40 mM是推荐浓 度，但是更高的浓度可能也是可以的。
	洗涤不够	重复洗涤步骤以获得最佳纯度。
	标签蛋白可能降解	加入蛋白酶抑制剂（避免EDTA）。并在4。C进行操作。
	杂蛋白可能是标签蛋 白产生相互作用	在超声处理细胞之前。可增加洗涤剂的水平（例如2% Triton X-100和2%  吐温-20），或添加甘油（50%）的洗涤液破坏非特异性相互作用。