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1 用18s RNA作为RT-PCR的内参，应该和β-actin是一个道理，半定量的目的是要看总RNA中的目的基因mRNA的表达量，内参的目的是去除一些系统误差。 2 有文献做过比较，之所以18s RNA比β-actin好是因为它含量丰富，且任何情况下稳定存在，所以受外界调控影响小，半定量时背景更加稳定 3 但是不同的是18s是rRNA，没有A尾巴，所以选它作内参时，l理论上总RNA转录时不能用OligodT作反转录引物，用随机引物或6聚体引物,OligodT转录出来的可都是mRNA啊！如果选β-actin就不存在这个问题，因为它mRNA，有A尾巴。 4 实际上,用18S rRNA做内参，反转录RNA用Oligo dT,能够扩增出来时,对结果也不要表示怀疑.因为普通条件下的反转不会很纯粹，mRNA的含量在总RNA中只占5%，反转时不是仅有它被反转录，即使是rRNA也是可以部分反转成CDNA的，要不分离纯mRNA怎么要用试剂盒进行进行磁珠吸附呢。另外，没有反转的rRNA和tRNA如果没用RNA酶处理也是可以存在很长时间才会完全降解的。这样的18S rRNA做内参是不合适的，它的表达会隋时间推移降低的。 你既然用18S rRNA做内参，就必须让其稳定表达。这样在反转录RNA时除用Oligo dT外，还要用18S反向引物，反转录后的CDNA最好还用RNA酶处理一下，再高温灭活。 |
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