新一代溶栓药物纳豆激酶

现代中西医结合杂志

ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2007Jul,16(19)

新一代溶栓药物纳豆激酶

邓立新

(海南省人民医院,海南海口570102)

[关键词]纳豆激酶;溶栓药物;血管栓塞

[中图分类号]R973[文献标识码]A[文章编号]1008—8849{2007}19—2775—02

血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一,是现今仅 次于癌症的第二大病症.目前,溶解血栓是治疗这一类疾病 的重要手段,当今用于临床治疗的药物包括链激酶(streptki— nase,SK),尿激酶(Umkinase,UK),组织型纤溶酶原激活剂(t— PA),单链尿激酶型血纤溶酶原活剂(ScUPA),化学修饰的血 纤溶酶一链激酶激活剂复合物(APSAC)等.这些药物均为 激活血液中的血纤溶酶原,从而降解纤维蛋白而间接地起作 用.临床应用方法是注射或滴注,有可能引起患者全身性内 出血,而且在血液中的半衰期很短(3,20min),因此在使用 这些药物时必须长时间的滴注用药,很不方便,且来源紧缺, 造价高.因此,开发新型溶血栓药物成为当前重要研究课题 之一.纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种能达到'经IEI纤溶 疗法'目的的,从世界数百种食物中筛选出来,安全性最高的 高效血栓溶解酶,有很强的溶血栓能力,跟传统的一些溶栓剂 相比,具有安全性好,成本低,口服有效等优点,极有可能开发 为新一代的溶栓剂.现将纳豆激酶的来源,理化性质,药理作 用,生产,与其他枯草杆菌蛋白酶的同源性比较,开发应用现 状综述如下.

1来源

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纳豆激酶是由日本学者SumilJ于1987年首次发现的, 它是纳豆发酵而产生的一种具有强烈纤溶作用的酶,该酶能 明显缩短优球蛋白的溶解时间.他们在研究纳豆芽孢杆菌的 生理生化特征后,认为其分类地位应归在枯草杆菌中.须见 洋行于1987年对纳豆及其提取物首次作了系统研究,最初将 酶的提取物添加到纤维蛋白平板上,发现有明显的溶栓作用, 并确定是一种具有纤溶活性的激酶…,从而使其成为一种很 有潜力的新型溶栓药物.纳豆激酶在日本已得到广泛深入的 研究,在我国还刚剐起步.

2理化性质

2.1分子量,分子结构纳豆激酶是一条由275个氨基酸残 基组成的单链多肽,分子量27728,PI8.0,其氨基酸序列与 其他枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列有较高的同源性.纳豆激 酶的活性部位在Asp22,His64,Ser221,与底物结合部位在 Ser125,Leu64,Gly127.对纳豆激酶最敏感的底物是Ser—Ala— Ala—Pro,PNA,其次是His—Asp—Val,Leu—Lys—PNLJ. 2.2等电点,稳定性纳豆激酶的等电点为8.6?0.3,在

DH6.0,12.0情况下,其比较稳定,pH低于5.0时,则很不 稳定.4O?保温30min,酶活无损失,温度>5O?时活力逐 渐丧失,>6O?时则因蛋白变而迅速失活【3J.反复冻融对纳 豆激酶的活性影响不大.当纳豆激酶与煮沸过的小麦或大米 提取液,肉汤及血清蛋白和胃黏液蛋白混合后,其稳定性显着 提高,甚至在酸性条件下仍保持有酶活性_4J.说明纳豆激酶 在胃环境中能保持一定的活性,因此可El服来达到溶栓目的. 3药理作用

大多数溶栓药物,如链激酶,尿激酶,t—PA等都是纤溶

酶原激活剂型,均需通过激活靶酶,即纤维蛋白溶酶原(Plas— minogen)转变为纤维蛋白溶酶,再与纤维蛋白结合,发挥溶 栓作用,而其自身不能直接作用于纤维蛋白.纳豆激酶则不

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然,它对纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感, 可直接将其水解成小肽和氨基酸.当把酶提取液滴加到纤维 蛋白平板上,短时间内即可出现透明的溶解圈,体外溶栓效果 显着.此外,将纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人 群的体内研究,表明其不仅可以抑制血栓的形成,还可迅速降 解纤维蛋白,增加纤维蛋白降解产物(FDP)的量,明显缩短血 浆中的优球蛋白的溶解时间(ELT),提高优球蛋白的纤溶活 性(EFA),并能降低PAl等纤溶酶原激活因子抑制子的活性, [J].江苏中医药,2004,25(2):57

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[收稿日期】2006—12—25

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从而激活静脉内皮细胞,引起tPA的继发性增加,同时激 活尿激酶原(proUK)转变为尿激酶,使内源性纤溶酶量和 活性间接增强,具有双重功能.研究表明,纳豆激酶的溶栓效 果远大于纤溶酶和弹性蛋白酶,活性是纤溶酶的4倍.另 外张利等Z6]通过纳豆激酶纤维蛋白溶解活性实验,纳豆激酶 体内血栓溶解实验对纳豆激酶的溶栓作用做了较全面的研 究.体内血栓溶解的实验结果显示:纳豆激酶可明显延长血 栓形成时间,显着减少股动脉的长度及湿质量并明显提高血 栓的再通率,显着减少肺内血栓的形成,表明纳豆激酶具有较 强的体内溶栓作用,且同等剂量的纳豆激酶和尿激酶相比,前 者的溶栓作用高于后者.显示了纳豆激酶具有强大的溶栓作 用,且起效快,药效长.由于纳豆激酶的安全性,稳定性和良 好的溶解血栓的作用,其有可能作为口服试剂用于血栓的预 防和治疗,成为一代新的溶栓药物.

4生产

最初获得的纳豆激酶都是从传统方法生产的纳豆中提 取,但不适用于大规模生产.因此人们转而探索液体发酵生 产的方法.日本的方法液体培养的最适温度为28.5?左右, 超过32?几乎不显示活性;最适碳源为麦芽糖.付利等J的 研究结果显示,发酵后4d酶活性达到最大,最适碳源为木 糖,最适氮源是大豆蛋白胨,最适温度为37?.本实验室的 实验结果与黑龙江应用微生物所得结果基本相符,与日本的 研究有出入,可能是由于菌种不同所致.

另外还有报道,在培养基中添加海带提取液,可以促进 NK的生产.由于纳豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓

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剂所无法比拟的优点,因此,人们渴望能将其开发为新一代的 溶栓剂.但从目前研究情况来看,纳豆激酶的产量还不高,难 以满足需要,故而要将其开发为实用的新型溶栓剂,提高纳豆 激酶的产量就变得非常关键.常用的提高纳豆激酶产量的途 径有3种:通过对野生菌种的筛选,诱变,挑选出产酶量高的 菌种;优化纳豆的发酵条件;通过基因工程技术改造纳豆激酶 的基因,得到产酶量高的工程菌.纳豆激酶作为微生物代谢 产物,只要有高活性的菌种,生产工艺条件成熟,就可实现大 规模生产,而且其发酵原料来源广,价格低廉,生产周期短,产 量高,且易于提取纯化,其开发应用前景十分广阔.

5与其他枯草杆菌蛋白酶的同源性比较

纳豆激酶同其他枯草杆菌蛋白酶具有很好的同源性,其 氨基酸序列同枯草杆菌蛋白酶E和枯草杆菌蛋白酶J比较而 言,分别仅有2个和4个氨基酸不同,纳豆激酶成熟区域的一 级结构同枯草杆菌蛋白酶E,枯草杆菌蛋白酶A分别具有 99.5%和99.3%的同源性.同其他枯草杆菌蛋白酶比较,纳 豆激酶表现出同枯草杆菌蛋白酶Carlsberg69%的同源性;同 枯草杆菌蛋白酶BPN有85%的同源性;与枯草杆菌蛋白酶 DY有70%的同源性,其同源序列都在氨基酸活性中心周围. 但乌赫特朗尼氏凝胶双向扩散实验表明在NK,BPN和Cads— berg之间没有交叉反应_9J.

6纳豆激酶的开发应用现状

目前,黑龙江省科学院应用微生物研究所已筛选出产纳 豆激酶活性高的菌株,探索出液体发酵罐生产纳豆激酶以及 分离提取纳豆激酶的生产工艺,并完成了对家兔动脉血栓溶 解作用试验,具有明显效果.同时上海医科大学分子遗传室 已经克隆了纳豆激酶基因,完成了DNA测序,并获得了纳豆 激酶的基因工程菌,表达量可达40%以上,建立了用工程菌 生产纳豆激酶的纯化工艺.纳豆激酶制剂恩开胶囊已处于中

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