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上一讲呢，本侠给大家介绍了WB的第一步：（总）蛋白提取。这一讲本侠接着跟大家说WB的第二步：蛋白电泳。 蛋白电泳 我们通常把“蛋白电泳”俗称为跑胶，如果按照这个字面意思来理解的话就是把蛋白质放在胶上跑，为啥要让蛋白质在胶上跑呢？上一讲我们说过，我们提到的蛋白是总蛋白，也就是说细胞里所有（理论上）蛋白都在里头了，但是我们要检测的只是其中的一两种，所以我们得想办法把各种蛋白质分离开，借助的方法就是跑胶。关于跑胶的原理，在第六讲说PCR的时候本侠已经跟大家解释过了，所以这里就不赘述了。与核酸电泳一样，蛋白质电泳也需要marker和loading buffer。与核酸电泳不一样的是，蛋白电泳（做WB时）的marker本身就是带有颜色的，在电泳过程中，我们可以清楚地看到marker上的每一个条带的位置，而核酸电泳的过程中我们是看不到marker的每一条带的，只有把胶经过核酸染料染色后，并且在紫外光下我们才能看到marker的条带。 关于loading buffer的作用，除了在PCR电泳里本侠提到的能让肉眼看到样本的位置以外（这是溴酚蓝的功劳），蛋白电泳中用到的loading buffer还有以下几个作用： 作用1： 帮助蛋白变性。蛋白质都是具有高级空间结构的，就算是同样分子量的蛋白质，也很有可能具有不一样的空间结构。而空间结构不一样的蛋白质在跑胶的时候速度肯定是不一样的。所以电泳之前，我们必须把“空间结构”这个干扰因素去除，尽量让蛋白质跑的速度只跟分子量相关。去除空间结构我们用的方法是将蛋白加loading buffer以后煮沸5min。Loading buffer里有一种强还原剂可以帮助破坏蛋白质中的二硫键（童鞋们如果不嫌弃的话可以用“扇嗅法”闻一闻loading buffer的味道，非常酸爽，那就是还原剂的味道）。 作用2：给蛋白质穿上带负电荷的外套。跑胶时候的干扰因素，除了空间结构以外，还有蛋白质所带的电荷。Loading buffer中含有带负电荷的SDS（十二烷基硫酸钠），在蛋白变性的同时，SDS会像一件外套一样穿到变性了的蛋白质的外面，使得所有的蛋白质都带上负电荷，这样在电泳的时候，所有蛋白都会一起向正极跑，而跑的速度只与蛋白质的分子量有关，因此这是一场公平的较量。 作用3：帮助蛋白质下沉。蛋白质在电泳前需要“上样”到胶上的上样孔中，而胶在电泳时需要浸在电泳液里，如果光靠蛋白质自身重力恐怕很难老老实实待在上样孔里，所以loading buffer里加入了具有较大密度的甘油，在与蛋白混合以后可以顺利地帮助蛋白沉到孔底。 说完了loading buffer的作用，我们来说说怎么用loading buffer。童鞋们先取一定体积提取好的总蛋白（蛋白质现提现用的话不用冷冻，如果提好的蛋白暂时不用，请记得一定一定要分装并-20℃冷冻。蛋白的体积取多少取决于你需要上到加样孔中的蛋白的质量，而蛋白的质量取决于你所需检测的蛋白的表达量的高低，第一次做可以先试试100ug），要注意买来的loading buffer一般是浓缩的，而最终的loading buffer的工作浓度是1*的，所以配制的时候需要用总蛋白(在裂解液中)稀释loading buffer。比如你买的loading buffer是5*的，需要上的蛋白量为100ug，根据蛋白定量结果计算得到上样体积为28ul，那就取28ul蛋白加7ul loading buffer混匀(可涡旋)。然后100℃煮5min。没错，loading buffer的使用就是so easy！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），总体上说，电泳的原理是先聚集、后分离。SDS-PAGE胶分为上下两部分，上面较短的部分为浓缩胶，下面较长的部分为分离胶。浓缩胶的作用是将所有的样本以较快的速度压缩到同一条起跑线上，以免出现“抢跑”的现象（所以本侠说这是一场公平的较量）。分离胶的作用就是我们在第六讲里说的“筛子”，它可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离，分子量小的蛋白跑得很快，冲在最前面，而分子量大的蛋白跑得比较慢，落在队伍的后面。为了达到不同的分离效果，我们可以通过调节“筛子”的孔径来控制蛋白质的移动速率。如果我们想要检测的蛋白质分子量较小（十几KD或者小几十KD），我们就把孔径调小一点，这样尽量让小分子蛋白很好地分离；如果我们想要检测的蛋白质分子量较大（上百KD），则相反地就把孔径调大一些。 配制SDS-PAGE胶主要用到的试剂有：30%丙烯酰胺溶液（俗称“AA母液”，这是形成“筛子”的主要成分，通过调节母液在所有成分中的比例就可以控制“筛子”孔径）、Tris-HCl（浓缩胶和分离胶使用不同的浓度和PH值，主要作用是通过控制甘氨酸的解离来调节蛋白电泳的速率）、TEMED（促使AA母液中两种主要成分聚合，使“筛子”形成）、10%过硫酸铵（APS，TEMED反应的催化剂）、H2O（调节体积）。这些试剂现在有市售的试剂盒，如果不嫌麻烦也可以自己配，还是那句话，看你是想省钱还是想省时间。不同百分比凝胶的配方童鞋们可以问度娘，也可以参考本侠后续推出的傻瓜式操作步骤。 正式配胶之前我们还需要一套装备，这套装备就是用来灌胶的容器。但是事实上，有能力做WB的实验室都拥有一套完整的蛋白杂交系统，系统里具有完成WB所需的所有仪器和模具（包括灌胶的容器）。市面上成熟、经典且有口碑的当属Bio-Rad公司的杂交系统，但这个系统有一个缺点，就一个字：贵！所以现在也出现了不少国产仿制品，有的仿的还很不错，但是价格是真心便宜。童鞋们先取出电泳的装备（如下图中红色字体标出的），其中A、B、短板（所有短板都一样）、长板（有尺寸，在板子的上缘有标记，数字越大，制出来的胶越厚，上样量就越多）和梳子是灌胶需要的。将一块长板和一块短板左、右、下边对齐，塞到B夹的夹缝中，关紧B夹，然后连B带两块板一起夹到A夹上，请注意这时玻璃板的下边缘和A之间应该有一个长条形海绵垫，不然兜不住胶。 图1 容器做好后，就可以按照自己的需要选择合适百分比的分离胶，找到配方，照着配方把相应体积的试剂加到一起。这里请童鞋们一定要注意，所有试剂唯独TEMED必须最后加，其它试剂都没有先后顺序。将所有试剂混匀（建议不要涡旋，以免产生过多气泡），用1ml枪头把液态分离胶沿B夹夹缝边缘（也就是箭头所指之处）缓缓加入玻璃板的缝隙中，直至B夹开关的上边缘，此时液面距短板上缘约1.5cm。剩余的分离胶暂时先放在容器里不要扔（有些童鞋手太快），用来观察胶凝固的情况。为了获得平整的分离胶上边缘，在分离胶加完之后，我们需要在分离胶上再封一层水，封水的时候本侠的习惯是用枪头沿着短板的上缘来回缓慢加水，这样会防止在固定位置加水形成的冲击造成相应位置分离胶上边缘不平。加水的量以加满两板之间全部缝隙为准（加溢出来也没关系，不用紧张，浪费点水而已）。等30min左右分离胶凝固（正常情况水面会下沉0.5cm左右），就可以倾斜A夹把玻璃板之间的水倒掉了，倒完水再用一小片滤纸塞进缝隙里把剩余的水吸吸干，等着配浓缩胶。配浓缩胶同样按配方，加试剂（TEMED还是最后加）、混匀，仍然沿B夹夹缝边缘缓缓加入玻璃板的缝隙中，浓缩胶可以加满缝隙也可以留点空隙，因为还要插梳子（梳子是用来留加样孔的），如果把握不好留多少的分寸，就干脆加满。加完浓缩胶，挑选合适尺寸（与玻璃板缝隙大小配套）的梳子插入浓缩胶中，注意避免产生气泡，如果有气泡就重插一次。同样，剩余的浓缩胶暂时也留着。30min左右待浓缩胶凝固（等待胶凝固的这一个小时可以先把电泳缓冲液和转膜缓冲液配好），就可以把梳子拔出来，把玻璃板从A、B夹上“解绑”，接着就可以安装电泳装置了。 安装电泳装置主要用到上图中的C夹和电泳槽。如果童鞋们只跑一块胶，那还需要一块塑料板（系统里有，童鞋们好好找找），如果有两块胶，那就可以同时跑。童鞋们先将带胶的玻璃板中短板那面朝向C夹，下缘卡到C夹下面的缝隙，这样整个板自然可以向C夹上“U”形绿边靠拢，我们需要做的是将短板与“U”形绿边紧贴。C夹的另一边同样用带胶的玻璃板短板（如果只有一块胶，就用塑料板代替，塑料板上突出的边缘与“U”形贴紧）与“U”形绿边紧贴，这样我们就可以利用两边的板和C夹做成一个槽，这里我们管它叫“内槽”。（做“内槽”时请识别下图中的小红框，然后请读小贴士8，一定！肯定！必须要读，不然可能造成电泳失败）“内槽”做好以后，关上开关把C夹夹紧，然后装到上图的电泳槽里（没有正反，放进去就行），这时C夹和电泳槽之间存在空间，我们管这个空间叫“外槽”。忽略C夹和玻璃板的话，“内槽”+“外槽”=整个电泳槽。到这里为止，电泳装备基本搭建完毕，现在把事先配好的500ml电泳缓冲液分别倒进“内槽”和“外槽”。倒的时候先倒“内槽”，原理上“内槽”内的液面只需没过短板即可，但是本侠习惯上喜欢倒满“内槽”，剩下的缓冲液全部倒进“外槽”。我们这里需要简单捋一捋通电的原理：“内槽”里的缓冲液与胶的上端（加样孔那头）接触，而“外槽”里的缓冲液与胶的下端接触，细心的童鞋会发现C夹的图示位置分别有两根铂金丝，缓冲液倒好后两根铂金丝就分别泡在“内槽”和“外槽”的缓冲液里，而这两根铂金丝又同时分别链接电源的两极，这样一来就相当于将胶的两端分别接通了电源的两极，形成回路。 图 2 好了，抓紧时间上样。这时加样孔已经泡在缓冲液里了，加样之前用200ul枪将每个孔吹打冲洗几遍以清除沉积在孔壁上的盐（这一步不做的话关系不大）。上样量比较大的话本侠建议用配白色枪头的20ul枪，童鞋们也可以使用100ul的微量进样针，只不过进样针容易产生漫天的气泡，气泡带着样本满世界跑，着实令人心烦。加样的时候别忘了加预染marker，是预染marker！样加好了，盖上电泳槽的盖子，盖子上有黑、红两根长辫子，要分别对准C夹上黑、红两个电极，千万别盖反了，盖反了样就飞了。盖好盖子，把长辫子插进电源，调节电压120V，开始电泳。后面就可以抽空干干别的事情了，时不时来看看溴酚蓝的位置就好。等到溴酚蓝快跑出胶的时候，停止电泳，蛋白电泳大功告成！ 下一讲呢本侠接着给大家说说WB第三步：转膜。  猪猪侠小贴士 1、电泳中的marker必须是预染marker（肉眼能看的见的），因为跑完胶以后胶上的蛋白质会被转到一张白白的薄膜上，最后用抗体识别完蛋白、显了色，蛋白条带是出现了，但是衡量蛋白条带大小的marker看不见，该怎么判断显色出来的蛋白条带就是我们要测的蛋白条带呢？ 2、非常重要，自己配凝胶各成分的童鞋必读！如果童鞋们选择自己配组成凝胶的各种试剂，本侠有必要提醒童鞋们，配制AA母液的时候，一定是最后将溶液定容到需要的体积。举个例子，如果童鞋们需要配制100mlAA母液，一定是用水将固体溶解后定容到100ml，千万不能取100ml水直接去溶解固体，两种操作得到的母液浓度相差非常大，因为固体的量很大。另外APS的配制也比较关键，倒不是配制的操作有多难，而是APS本身的质量对胶凝固的效果有比较大的影响，所以童鞋们尽量选择牌子好点的，最好是进口的APS来使用。配胶的过程对于TEMED的要求不高，本侠实验室有放了很多年的TEMED，照样用的很嗨。 3、灌胶的时候沿着夹缝缓缓加的目的是为了防止形成气泡，最后影响分离胶的质量。 4、分离胶凝固以后如果水面不下沉，这属于不太正常现象，如果童鞋们胆子大，可以继续做，如果胆子小，就把胶抠了重做吧。但是分离胶凝固以后水面下沉太多，这属于太不正常现象，说明漏胶了，妥妥的抠了重做吧，不过重新做之前先看看究竟哪里漏了，不然下回还是漏。还有一种情况，本侠曾经见过分离胶凝固以后水面上浮的，额……请恕本侠脑洞太小。 5、如果漏胶，可能的原因有：两块板的底部没有齐平；海绵太硬；海绵快烂了。再有就是人品有问题。 6、关于分离胶配制的体积，建议第一次做WB的童鞋们用水先试一下需要多少，然后再配，不同厚度的胶需要的胶的量相差还是挺多的。 7、如果童鞋们配浓缩胶的时候出了什么问题，比如忘了插梳子，先别急着推翻重来，可以用滤纸把浓缩胶掏出来，再用水打进去洗洗，然后再用滤纸擦干，就当什么事情都没发生过，重新配一次浓缩胶就好，因为分离胶还是好的。但是，如果分离胶出了问题，那就呵呵哒了。 8、用两块板和C夹做“内槽”的时候，有一个非常关键的注意点，童鞋必读！图2中本侠用红框框出了“U”形绿边的一部分，这一部分有个特殊结构，这部分比U”形绿边的其它部分都要“凸”，这种设计是为了吻合长短板的上端的。配好胶的长短板上端，长板比短板长一点，在整体上看就好像上端“凹”进去了，所以，把带胶的玻璃板装到C夹上时，一定要将“凹”和“凸”的边缘对齐、挤紧了，防止“内槽”的电泳液漏出。电源接通后，正常情况下两根铂金丝都会很卖力的冒泡，如果铂金丝不怎么冒泡，很可能就是“内槽”电泳液漏了，回路不能形成，蛋白就跑不动。 9、电泳缓冲液和转膜缓冲液的配方也请童鞋们问度娘，不难。只是转膜缓冲液最好跟电泳缓冲液一起配，因为转膜缓冲液需要预冷，配好的转膜缓冲液就放到4℃降温。转膜缓冲液配800ml即可。 10、关于电泳时采用的电压，本侠的习惯是120V到底。但是有些小伙伴喜欢浓缩胶和分离胶用不同的电压，本侠个人认为区别不大，童鞋们自行选择。 11、关于电泳的时间，本侠喜欢把溴酚蓝跑到胶底，这样蛋白会分的很开。但是本侠也曾经试过很多次，一旦marker上的每条条带都能分开就停止电泳，也能做出来，童鞋们自己看情况吧，如果实在着急的火烧眉毛，那就采用省时的方法好了。但是如果童鞋们要做的蛋白分子量比溴酚蓝还小的话（当然可能性不大），就不要坚持将溴酚蓝跑到底了，不然你要的蛋白就到“外槽”的电泳液里去了。 12、如果童鞋们觉得就算把最大的上样孔都上满也不够要求的话，本侠可以教童鞋们一个歪门邪道。童鞋们可以上完一次样开始电泳，等到加样孔空出来了，停止电泳，再加一次样，继续电泳。但是童鞋们要注意一定要加样孔一空出来就停止电泳，不然两次加的样就压不到一条起跑线上了。 13、上样的时候如果发现上样孔下面有个泡，说明插梳子的时候带进气泡了，别紧张，关系不大，继续做。 14、最后本侠满足一下只需要做蛋白电泳的童鞋们，如果有童鞋只需要做蛋白电泳，并不需要做WB，那么除了上样的时候要用没有预染的marker以外，其它操作都一样。因为跑完的整块胶都是要拿去染色的，marker也会被染上色。当然喽，如果有钱也是可以任性的。 |
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