一种人调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法与流程

本发明涉及一种快速评价外周血中调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法。该方法用于监测调节性T细胞的抑制活性，属于生物技术领域。

背景技术：

人体的免疫系统受多重精密调节，其中调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)发挥重要的免疫负调节作用，是阻断免疫监测和抑制有效抗肿瘤免疫的主要免疫细胞。Treg细胞在体内所占的比例很少，在正常人外周血中仅占CD4⁺细胞的5-10%左右，而具有免疫抑制能力的Treg细胞比例更低。Treg细胞表达多种细胞表面分子，如CD4、CD25、FoxP3、CTLA4、GITR和CD103等，如何识别检测具有免疫抑制功能的特异性Treg细胞是目前细胞治疗研究的重点。早期曾认为转录因子FoxP3是Treg细胞最特异的标记物，但是仅表达FoxP3不足以定义Treg细胞及决定Treg细胞的功能和表型，最新研究发现，还有其他的分子标志影响了Treg细胞的成熟和功能。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明在现有检测技术基础上，优化了一种体外检测调节性T细胞免疫功能的方法，利用Helios结合CD4\CD25\FoxP3作为标记功能性Treg细胞的方法，在总体调节性T细胞中通过发现靶位找到具有实际调节功能的细胞群，可以更有效的检测具备免疫抑制功能的细胞群体，达到科学量化具有抑制活性的调节性T细胞的目的。

下面对本发明步骤进行详细描述：

1 采集：取外周血5-10ml；

2 处理样本：取流式管分别加入100μl外周血样本，每管加入2ml红细胞裂解液，混匀后室温孵育15分钟，1500转/分20℃离心5min洗涤1遍，加入2mlPBS液相同条件再次洗涤1遍，加入100μl PBS液重悬成单细胞悬液；

3. 表面抗体的标记：加入抗体CD4、CD25各5μl标记调节性T细胞表面分子标记，室温避光孵育20分钟，PBS液1500转/分20℃离心5min洗涤1遍；

4.细胞固定破膜：加入1ml 固定破膜剂：10%甲醛/0.2%Triton-X/PBS重悬细胞，室温避光孵育1小时，加入2ml PBS液洗涤2遍；

5.核内抗体染色：加入100μl PBS液重悬细胞，加入核内抗体Foxp3、Helios各5ul标记核内抗体，室温避光孵育1小时，加入2ml PBS液洗涤2遍；

6.流式检测：加入400μl的PBS液重悬成单细胞悬液，滤网过滤加入流式孔板，流式细胞仪上机检测CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Helios⁺细胞占CD4⁺细胞比例；

7 单个核细胞分离：外周血全血样本按照体积比1：1的比例将外周血缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液中，2500转/分 离心25-30分钟，收集中间白膜层的单个核细胞，加入15ml PBS液，1800转/分，离心10分钟，洗涤2遍；

8 分选：磁珠分选CD4⁺CD25⁺Treg细胞，其中阴性分选CD4⁺细胞，阳性分选CD25⁺细胞，CFSE实验检测不同组CD4⁺CD25⁺Treg细胞对CD4⁺CD25^-Th细胞的免疫抑制功能；

9检测：构建Helios siRNA，将Helios siRNA转染到分选后的ALL CD4⁺CD25⁺Treg细胞中，CFSE实验检测Treg细胞免疫抑制功能，未转染Treg细胞作为对照组。

综上所述，本发明的目的是针对目前对Treg细胞分子标记的不完善，提供一种新的具有较强免疫抑制功能的人外周血Treg细胞免疫标记，从而检测T细胞的免疫抑制功能。

附图说明

图1：ALL与健康儿童外周血中CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Helios⁺Treg细胞的比例；

图2：ALL与健康儿童外周血中Treg免疫抑制功能的差别；

图3：Helios表达对Treg免疫抑制功能的影响；

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

Treg细胞检测

本实施例所用材料主要如下：

（1）标本来源：该实例使用经初发ALL患儿和正常健康查体患儿家属同意授权的外周血作为单个核细胞的来源，共采集 10份ALL外周血和10份正常对照外周血，加入肝素抗凝，每份3-5ml；

（2）主要试剂：鼠抗人CD4-FITC、FoxP3-APC抗体购于美国ebiosicence公司，鼠抗人CD25-PE-Cy5、Helios-PE抗体分别购于美国Biolegend公司，FoxP3 Fix/Perm buffer购于ebioscience，红细胞裂解液购于美国BD Biosciences公司，细胞计数仪为Beck-man coulter(美国)，GuavaeasyCyte 6HT流式细胞仪为美国EMD Millipore公司生产；

（3）CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Helios⁺细胞占CD4⁺T细胞比例的流式检测：取流式管分别加入100μl外周血样本，每管加入2ml红细胞裂解液，混匀后室温避光孵育15分钟，1500转/分20℃离心5min洗涤1遍，加入2ml PBS相同条件再次洗涤1遍，加入100μl PBS重悬成单细胞悬液。向其中加入CD4-FITC和CD25-PE-Cy5抗体各5μl，混匀，室温避光孵育20min，经PBS洗涤离心后分别加入1ml Fixation/Permeabilization固定破膜剂，室温避光孵育30-60min，用1×Perm buffer洗涤2次后，加入FoxP3-APC(同型对照管加入5μl小鼠IgG r1-APC)和Helios-PE(同型对照管加入5μlArmenian Hamster IgG)各5μl ，避光孵育30-60min，经1×Perm buffer洗涤2次，用400μl PBS重悬，上流式机检测CD4⁺ CD25⁺FoxP3⁺ Helios⁺ Treg占全血CD4⁺细胞的百分比（图1）。实验结果示：pre-B ALL组中，CD4⁺CD25⁺ FoxP3⁺ Helios⁺ Treg细胞占CD4⁺T细胞比例为（6.16±0.79）%，明显高于对照组（2.62±0.34）%，差异具有显著性的统计学意义（p=0.005）。

实施例2

单个核细胞的分离和Treg细胞的分选

（1）标本来源：该实例使用经初发ALL患儿和正常健康查体患儿家属同意授权的外周血作为单个核细胞的来源，共采集 5份ALL外周血和5份正常对照外周血，加入肝素抗凝，每份10ml；

（2）主要试剂：淋巴细胞分离液购自Sigma公司，CD4⁺CD25⁺Treg细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪(autoMACS Pro Separator)、MACS buffer、LD及MS MACS分离柱均购自德国Miltenyi Biotec公司；

（3）单个核细胞分离：抽取肝素抗凝外周血10ml，外周血加入等量PBS液稀释，取50ml离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液20ml，将20ml稀释后血液沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2500转/分20℃离心30min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，加入15ml PBS，1800转/分×10分钟离心洗涤2次，细胞计数大约有1×10⁷-2×10⁷单个核细胞，每1×10⁷细胞加入90ulPBS重悬；

（4）Treg细胞的MACS分选：取分离后的单个核细胞，每10⁷个细胞加入Biotin-Antibody10ul混匀，置于2-8℃孵育5min，加入20μl Anti-Biotin Microbeads/每10⁷个细胞，混匀，2-8℃孵育10min，将细胞调整至500μl体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4⁺T细胞(阴选)，用PBS将细胞洗涤离心后，每10⁷个细胞加入PBS 90μl重悬，每10⁷个细胞加入CD25MicroBeads20ul，混匀，在2-8℃孵育15min，加入1ml PBS洗涤离心，倾去上清，重悬至500μl，过LS柱，把separator移开，放置1ml PBS于LS柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4⁺CD25⁺T细胞(阳选)，加入Treg培养基培养基继续培养。留取一部分细胞进行流式细胞学检测，流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺阳性细胞分选率达90%以上。

实施例3

Treg细胞免疫抑制功能的检测

（1）主要试剂：共培养培养基：1640培养基中加入10%胎牛血清，100U/ml青霉素+链

霉素，50μM/L 2-巯基乙醇和2mM/L L-谷氨酰胺，200IU/mL rhIL-2。CD3/CD28 dynbeads购自美国Invitrogen公司，CFSE购自日本同仁化学研究所；

（2）将实施例2中分选出的CD4⁺CD25^-细胞洗涤，加入PBS将其调整成1×10⁷浓度，按照CFSE说明书标记5μM CFSE，37℃孵育15-30分钟，PBS洗涤2次，取1×10⁶按细胞数2：1的比例分别与实验组1、实验组2、对照组Treg细胞加入6孔板共培养，培养基使用共培养培养基，培养基中另加入比例为1：1的 CD3/CD28 dynbeads，培养72小时后利用流式细胞仪进行细胞增殖检测，利用Modfit FLT软件分析结果，如图2。结果示:实验组CD4⁺CD25⁺T细胞抑制能力较对照组有明显统计学意义的升高（11.40±0.64 vs 14.53±0.20，p=0.009）。

实施例4

Helios表达对Treg细胞功能的影响

为检测Helios基因对Treg细胞功能的影响，在白血病Treg细胞中转染Helios-siRNAs下调Helios表达，Helios-siRNAs由吉马生物有限公司合成。实验分为两个组：Helios-siRNA转染组和对照组，按照Lipofectamine 2000的说明进行操作将两组siRNA分别转染到Treg细胞中，转染48小时后进行定量PCR检测Helios基因表达下降，如图3， CFSE共培养抑制实验结果显示siRNA-Helios组Treg细胞的免疫抑制功能较对照组平均下降34%（24.00±1.73 vs 16.33±0.88，p=0.001）。