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摘要 与乙型肝炎病毒（HBV）感染相比，丙型肝炎病毒（HCV）感染对干扰素（IFN）治疗更为敏感。目前研究对于HBV是逃避还是主动抑制干扰素介导的免疫反应还存在争议，同时HBV与HCV共感染肝细胞时病毒间的相互作用及机制也有待阐明。该研究利用HepaRG细胞和原代人肝细胞（PHHs）探究了HBV与IFN介导的免疫反应之间的相互作用，同时在单细胞水平分析了HBV和HCV对彼此复制的影响。结果显示，HBV体外感染dHepaRG-NTCP细胞并不会通过模式识别受体（PRRs）激活或抑制下游信号通路；用IFN处理dHepaRG-NTCP或PHHs细胞，对HBV复制及cccDNA水平的影响有限。同时，HBV感染后并未抑制JAK-STAT信号通路，也没有上调IFN刺激基因（ISGs）的表达，表明HBV可以逃避IFN分泌及其诱导的抗病毒作用。此外，在共感染细胞中，HBV并不影响IFN对HCV复制的抑制作用。  01 HBV可在免疫功能正常的dHepaRG-NTCP细胞和PHHs中复制并逃避胞内PRRs识别 为了探究HBV是否可在生命周期的某个阶段诱导干扰素（IFN）反应，作者用D基因型HBV感染了免疫功能正常的dHepaRG-NTCP细胞和PHHs。HBV核心蛋白免疫荧光染色显示dHepaRG-NTCP细胞感染率约为5%，而PHHs则>90%。随后，通过检测前基因组RNA（pgRNA）、乙型肝炎 e抗原（HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的水平变化，证实了HBV可感染这两种细胞系并在胞内进行复制。尽管如此，作者并未在上述细胞培养体系中检测到IFN-λ1或IFN-β，多种ISGs的mRNA水平也没有改变，提示HBV感染后缺乏IFN应答。  图1. 在dHepaRG-NTCP细胞中，HBV对RIG-I、MDA5或TLR3介导的信号通路激活没有影响。 RVFVΔNSs：激活RIG-I；Mengoᙆⁿ病毒：激活MDA5；poly (I:C)：激活TLR3信号通路。HBV核心蛋白（红色荧光）；NK-κB（黄色荧光）；GFP-IRF3（绿色荧光）；细胞核（灰色）。HBV感染且未发生核转位细胞（亮蓝色箭头）；HBV感染且发生核转位细胞（粉红色箭头）；HBV阴性且未发生核转位细胞（玫瑰色箭头）；HBV阴性且发生核转位细胞（白色箭头）。 接下来，通过检测NK-κB和IRF3的核转位来反映细胞因子应答的早期激活水平，从而区分HBV的免疫逃逸是被动还是主动。免疫荧光可用于检测内源性NK-κB的水平，但是直接检测内源性IRF3较困难。为了更好地监测内源性IRF3的水平变化，作者构建了稳定表达IRF3（带GFP标签）的细胞系dHepaRG NTCP GFP-IRF3，并在单细胞水平上对IRF3的核转位情况进行了监测。在已建立HBV感染的dHepaRG NTCP GFP-IRF3细胞中加入不同配体进行刺激，以探究HBV是否能阻断RIG-I、MDA5或TLR3介导的信号通路。结果显示，无配体刺激时，HBV阴性组和HBV感染组均未发生NK-κB核转位（图1A）；加入配体刺激后，在HBV感染组同样观察到了明显的NK-κB核转位，表明HBV并未主动阻断这一过程（图1A和C），PHHs实验也证实了这一结论。GFP-IRF3的核转位情况与上述结果相似（图1B和D），尽管在未刺激时，HBV感染组GFP-IRF3核转位的基线水平稍高于HBV阴性组，但是加入配体刺激后，两组的核转位水平并没有明显差异。此外，将HBV阴性且加入配体刺激组的细胞上清与未刺激组共孵育，并未观察到NK-κB和GFP-IRF3的核转位现象，表明HBV阴性细胞释放的细胞因子同样无法诱导核转位发生，排除了旁分泌的干扰。 02 HBV对IFN-α中等敏感且不会阻断JAK-STAT通路及ISG表达 为了探究HBV是否对外源IFN治疗敏感，按照不同方案对dHepaRG-NTCP细胞给予IFN-α处理（图2A）。与此前研究一致，加入IFN-α处理后，HBV感染细胞数（图2B）、HBeAg和HBsAg分泌水平（图2C和D）以及pgRNA水平（图2E）都出现了下降，但各方案的病毒学指标下降幅度有所不同。在HBV感染前及感染后持续给予IFN-α处理对病毒的抑制效果最好（情况A），病毒学指标下降到了未处理组20%~30%的水平；在HBV感染后持续给予IFN-α处理使得病毒学指标下降了将近一半（情况B）；在感染后开始给予IFN-α处理但在第4天停止给药（情况C），或是在感染后4-10天给药（情况D）对HBV复制的抑制效果最差。值得注意的是，不同给药方案均未降低cccDNA水平（图2F），与既往研究认为IFN-α主要通过抑制转录和/或RNA翻译水平来阻断HBV复制的结论一致。此外，IFN-α处理并未影响NTCP受体水平或与PreS1结合的能力，与既往报道IFN-α可抑制HBV感染细胞的过程存在差异。  图2. IFN-α诱导的抗病毒应答抑制HBV复制的作用有限。 根据不同方案给予HBV感染dHepaRG-NTCP细胞100 IU/mL的IFN-α处理。通过流式细胞术对HBc阳性细胞进行计数来反映HBV感染细胞数。 随后，作者用不同浓度的IFN-α处理dHepaRGᴺᵀᒼᴾ细胞后，检测了磷酸化STAT1（pSTAT1）的核转位及ISG表达情况，以探究HBV是否会主动抑制IFN-α介导的信号通路。在未处理细胞中，HBV阴性和HBV感染组均未检测到核内的pSTAT1信号；而加入IFN-α处理后，HBV阴性和HBV感染组均检测到了pSTAT1的核转位，表明HBV并未阻断STAT1的磷酸化及后续的核转位过程（图3A）。发生pSTAT1转位的细胞比例以IFN浓度依赖的方式增加，最高可到将近100%（图3B）。在任一浓度IFN处理下，HBV均未阻断pSTAT1转位；相反，在低浓度IFN-α处理时，HBV感染可增加pSTAT1核转位水平。如同样在10 IU/mL IFN-α处理下，HBV阳性细胞（HBc免疫荧光染色阳性，提示有HBV感染）中发生pSTAT1核转位的细胞数是HBV阴性细胞（无HBV感染）的两倍（图3B）。此外，作者还通过流式细胞术检测了ISG Mx1的表达水平（图3C），结果显示未刺激细胞中无法检测到Mx1，加入IFN-α处理后，Mx1表达水平以剂量依赖的方式升高，且HBV感染组Mx1水平高于未感染组（图3D）。上述结果表明，在免疫功能正常的细胞中，HBV并不会影响IFN-α介导的ISG的表达（批注1）。  图3. HBV不会阻断IFN-α介导的信号通路和后续ISG表达。 核DNA：DAPI，灰色；HBV核心蛋白：红色荧光；pSTAT1：绿色荧光；HBV感染且未发生pSTAT1核转位细胞：亮蓝色箭头；HBV阴性且未发生核转位细胞：玫瑰色箭头；HBV感染且发生核转位细胞：粉红色箭头；HBV阴性且发生pSTAT1核转位细胞：白色箭头。 03 HBV不会抑制IFN对HCV的抗病毒作用 尽管HBV/HCV共感染的发生率较低，但是患者发生严重肝损伤的风险与单一感染相比显著增加。为了探究HBV/HCV共感染对IFN治疗应答的影响因素，首先需要构建共感染的细胞模型。HepG2-NTCP、dHepaRG-NTCP和PHHs等虽然支持HBV复制，但均无法建立持续的HCV感染。Huh7.5细胞虽然适合HCV复制，但是HBV很难侵入并建立感染。为了解决HBV感染的问题，作者在体外用连接酶构建了环状且表达增强的HBV全长基因组，并将其转染到了Huh7.5细胞中，用于替代cccDNA（图4A）（批注2）。转染后7天，约有10%的细胞表达HBV核心蛋白（图4B），同时转染后10天仍能稳定分泌HBeAg，且表达量稍高于转染1.1×HBV质粒组（图4C）。在HBV建立复制的基础上，再利用HCV感染Huh7.5细胞，并在单细胞水平上对HBV核心蛋白和HCV的NS5A蛋白表达进行了检测。结果显示，存在共表达HBV核心蛋白和HCV NS5A蛋白的细胞，且二者的表达水平未见明显相关性（图4D和E），证实共感染细胞模型成功建立，HBV不会干扰HCV感染Huh7.5细胞。  图4. Huh7.5细胞HBC/HCV共感染模型建立 利用上述共感染细胞模型，作者进一步探究了HBV是否会抑制IFN应答，以及阻断外源IFN对HCV的抗病毒作用。在HCV感染前（“pre”-treatment）或感染后（“post”-treatment）加入IFN-α或IFN-λ1进行处理（图5A），并通过检测病毒蛋白表达情况反映其复制水平。结果显示，HBV复制几乎不受影响（批注3），但HCV下降了约80%（图5B和C）。值得注意的是，治疗后HCV阳性细胞数的下降幅度在HBV阳性和HBV阴性组之间没有差异，表明HBV并未影响IFN-α及IFN-λ1的抗HCV活性（图5B和C）。综上，HBV不会干扰IFN诱导的信号通路，且无法阻断相关细胞因子的对HCV的抗病毒作用。  图5. HBV不会干扰IFN-α及IFN-λ1的抗HCV活性 讨论 为探究HBV是否能在其生命周期的某一阶段诱导IFN应答，该文作者首先用HBV感染了免疫功能正常的dHepaRG-NTCP细胞和PHHs。结果显示，HBV并未阻断IFN应答通路。利用IFN-α处理dHepaRG-NTCP细胞后，HBV感染细胞数量、HBeAg和HBsAg分泌，及pgRNA水平均降低，但cccDNA水平没有明显变化。据此，作者认为IFN-α主要在转录和/或RNA翻译水平阻断HBV复制。随后，作者用不同浓度的IFN-α刺激了HBV感染的dHepaRG-NTCP细胞，以探究HBV是否可通过影响pSTAT1的核转位和ISG表达水平来阻断IFN-α介导的信号传导。结果表明，在免疫功能正常的细胞中，任一IFN浓度下HBV均不能阻断pSTAT1转位，也不会抑制IFN-α介导的ISG表达。 此外，研究还发现，在HBV/HCV共感染的情况下，HCV不会影响HBV复制，HBV也不影响HCV感染Huh7.5细胞的过程，且HBV不会减弱IFN对HCV的抗病毒作用。同时，作者注意到既往部分研究与本研究结果不同，如HBV对IFN信号的干扰、HBV对PRR介导信号的抑制等，这些差异可能是因为其他研究大多基于单一HBV蛋白的过表达。不仅如此，包括本文在内的许多研究只分析了来自肝细胞的反应，但是实际HBV感染过程中还有免疫细胞的参与，这可能解释了IFN成功治疗与激活不同的免疫途径有关。在本研究中，HBV对IFN诱导的抗病毒作用并不敏感，同时IFN对HBV感染细胞的复制水平影响较小，进一步证实了HBV是一种能够逃避先天免疫应答的“隐形病毒”。  图6. HBV逃避先天免疫且不干扰IFN抗HCV活性 阅读过程中的讨论 批注位置见上文标注 批注1 问：从显示的结果看，合并HBV感染甚至在一定程度上会增强IFN-α处理后的以Mx1为代表的ISG的表达。我国曾开展过较多的长效干扰素抗HCV临床研究，合并HBV感染的丙型肝炎患者是否对长效干扰素治疗有更好的HCV病毒学应答呢？ 答：关于这个问题，暂时还没有查到相关的研究可以回答。不过Mx1是广谱的抗病毒因子，对RNA病毒作用较强，这里虽然HBV感染后有一定升高，但是幅度不大，所以是否会明显增强对HCV的抑制作用还不能确定。虽然该研究根据共感染实验得出结论两种病毒之间不会相互干扰，但是由于Huh7.5的RIG-I存在缺陷，干扰素信号传导是受影响的，所以无法确定HBV感染后诱导的ISG是否会对HCV复制产生抑制作用。 此外，今年的一项研究（Wang, Yong-Xiang et al. Journal of hepatology(2020)）表明Mx2相比Mx1具有更强的抗病毒活性，对HCV和HBV都有一定的抑制作用，但可惜这里没有Mx2的数据。 批注2 既往研究显示，Huh7.5细胞系的模式识别受体RIG-I突变，影响了内源性的干扰素信号通路，故此处用该细胞系研究HBV与HCV之间的相互作用并不恰当。后续得出的结论只能提示两种病毒之间可能不存在直接的相互作用，但是无法排除通过干扰素通路影响病毒复制的可能性。 批注3 “HBV复制几乎不受影响”与前面实验结果（图2）不一致。如果仅是根据图5B top panel的core蛋白染色阳性的细胞数占比，那么，该结论是存疑的。这是因为，影响“core蛋白染色阳性细胞数占比”的是1.3xHBV质粒DNA的转染效率，而不是HBV病毒的复制效率。定量检测细胞培养上清的HBsAg、HBeAg和HBV DNA，或许能给出答案。 文献来源： Mutz P, Metz P, Lempp FA, et al. HBV Bypasses the Innate Immune Response and Does Not Protect HCV From Antiviral Activity of Interferon. Gastroenterology. 2018;154(6):1791-1804.e22. doi:10.1053/j.gastro.2018.01.044 （来源：片警实验室） |
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