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编译：王一，编辑：Emma、江舜尧。
背景：高胆固醇血症和高循环胆固醇与心血管疾病（CVD）的发生和发展密切相关，而CVD导致的死亡占现代工业化国家死亡人口总数的四分之一。胆固醇的血清浓度受其两个主要来源影响：肝脏中合成的内源性胆固醇和饮食成分中动物来源的外源性胆固醇（图1），它们会分泌至小肠并最终进入血浆。人们在阐明肠道微生物的胆固醇代谢是如何影响血清胆固醇水平这一问题上已有100多年历史。前人工作表明，进行饮食干预或他汀类药物干预能影响肠道胆固醇水平，依替米贝(Ezetimibe)（FDA批准的肠道胆固醇吸收抑制剂）的使用能抑制肠道吸收胆固醇。肠道微生物对胆固醇的代谢也会减少肠道对胆固醇的吸收，进而降低血清胆固醇水平（图1）。这些肠道细菌是通过间接还原途径将胆固醇代谢为粪甾醇的，该途径涉及到胆固醇(1)被初始氧化为胆甾烯酮(2)，进而Δ4,5双键还原成粪甾烷酮(3)，随后再还原酮生成粪甾醇(4)（图1）。但对于肠道微生物，基因和催化粪甾醇形成的特异酶的了解相当有限，因此对这一关联性的机制探索仍然遥遥无期。
方法优势与创新：本研究的一大看点是对微生物组学数据的深度分析和挖掘策略。研究人员重点关注了肠道菌群能将胆固醇转化为不易吸收的粪甾醇的特性，进而开发出一种能鉴定功能酶和功能微生物的多学科框架流程，能够从一类未培养的肠道细菌群体中鉴定和表征广泛的胆固醇脱氢酶家族，这类肠道细菌能够在胃肠道中介导胆固醇代谢为粪甾醇。通过将现有群体的宏基因组和代谢组学关联数据与生化实验数据相结合进行充分分析挖掘。这种挖掘策略也可应用于其他有趣的途径或代谢物中，无论涉及该代谢的微生物是什么，都能进一步鉴定和表征微生物群主导生物过程中涉及的酶，这对于微生物组研究尤其重要。
原名：Cholesterol Metabolism by Uncultured Human Gut Bacteria Influences Host
Cholesterol Level 译名：未培养的人体肠道细菌的胆固醇代谢影响宿主胆固醇水平
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.923 发表时间：2020.08 通讯作者：Emily P. Balskus& Ramnik J. Xavier
通讯作者单位：博德研究所 1. 人类肠道微生物组中假定的胆固醇代谢酶鉴定 首先通过分析肠道微生物组找到与粪便代谢组中粪甾醇有关联的酶编码基因。从不同地理位置搜集了肠道微生物组数据集（n = 3,097）并进行从头组装，产生了5,929,528个非冗余完整基因。为了将具有相似分子功能的蛋白质联系起来，更好地综合分析粪便代谢组学数据，将这些基因分组为同源蛋白质簇（基于序列的同源性，最低限50％ aa），能将具有相似分子功能但序列不同的蛋白质有效地归为一组，随后对来自两个独立数据集共625个样品的粪便宏基因组学和代谢组学数据进行匹配。为找到与肠道粪甾醇产生有关的蛋白，将这些样本中同源蛋白簇与粪甾醇进行了关联分析（图2A），衍生出反映相关性强弱的指标：敏感性和特异性，能反映该蛋白簇与粪甾醇检测之间的密切程度。经过对指标的调整，对蛋白质簇的指标调整为敏感性> 0.3和特异性> 0.9，将有希望找到与粪甾醇相关性强的蛋白质簇，并进行后续实验验证。为鉴定最有可能包含胆固醇代谢酶的蛋白质簇，研究人员整合了先前报道的相关细菌基因组信息。其中，20世纪从养猪污水中分离到的E.coprostanoligenes HL (ATCC 51222)菌株效果最好，对该菌进行了测序并组装出高质量的全基因组，以验证粪甾醇的形成过程。经分析发现该菌株约80%的蛋白质能比对到上文中组装的同源蛋白簇上（50％aa相似性），这些蛋白中有328个在粪甾醇检测中的指标达到敏感性> 0.3，特异性> 0.9（图 2B）。通过整合筛选结果和菌株基因组信息，大大缩小了寻找参与胆固醇代谢的候选酶的范围。假设E.coprostanoligenes的未知胆固醇代谢酶与生成粪甾醇的人类肠道微生物酶是有关系的，那么接下来对该菌株是如何完成粪甾醇生成这一过程进行研究。早期研究表明，E.coprostanoligenes体内的粪甾醇的形成途径涉及胆固醇（1）最初氧化为胆甾烯酮。据此，研究人员分别在有氧和无氧条件下测试了该菌株裂解物对胆固醇的反应活性，发现胆固醇确实能转化为胆甾烯酮，且该反应需要NADP ，且不依赖氧。而该途径的假定的第二步是从胆甾烯酮（2）生成粪甾烷酮（3），在本研究的验证试验中并未检测到这一步反应。这表明测定条件需要进一步优化，或者假定的酶在细胞裂解过程中会失活。因此，研究人员首先考虑了胆固醇氧化酶作为胆固醇代谢酶的可能性。肠道属于厌氧环境，该菌株细胞裂解液中的胆固醇氧化与氧气无关，所以先排除掉氧依赖性的酶。那么能够以不依赖氧为特征进行此反应的酶还剩土壤脱细菌斯特氏杆菌（Sterolibacteriumdenitrificans）的胆固醇脱氢酶AcmA（PF01370）和结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）的Rv1106c。有趣的是，这两个酶在人类微生物组基因目录中有大量同系物，将这些同系物匹配到研究人员的两个代谢组学数据集中，对粪甾醇均不具有很高的特异性和敏感性（图2C）。因此，研究人员考虑的最后一类酶是羟基类固醇脱氢酶（HSD），它属于短链脱氢酶（SDR）家族（PF00106）。这些酶在许多肠道微生物中都有，以NAD（P） 依赖性，氧依赖性的方式将胆汁酸的羟基氧化为酮。进行比对分析后发现，HSD簇中的四个簇含有E. coprostanoligenes蛋白的同系物，包括25个与粪便中粪甾醇形成有关的蛋白，其特异性指标为0.92，敏感性指标为0.68（图2D）。总之，宏基因组挖掘结合代谢组学，基因组和酶指向的生物信息学分析，将6M微生物组基因浓缩至4个蛋白质簇，对其优先顺序进行实验验证。
图1 血清胆固醇水平对人类健康很重要，可由多种因素调节，包括肠道菌群对胆固醇的潜在代谢
图2 人类粪便宏基因组，代谢组，菌株全基因组和酶功能综合分析揭示了人类肠道微生物组中参与胆固醇代谢的候选细菌基因
2. 假定的肠道微生物胆固醇脱氢酶的生化特征 为了测试上文中优化得来的蛋白簇是否可以将胆固醇（1）氧化为胆甾烯酮（2），在大肠杆菌中表达了由E.coprostanoligenes编码的四个拟定的HSD，并评估其细胞裂解液对胆固醇的反应活性（图3A）。结果发现粪便代谢组中对粪甾醇具有最高特异性的E.coprostanoligenes HSD酶是ECOP170（WP_078769004.1），能将胆固醇氧化为胆甾烯酮，完成胆固醇代谢的第一步。同时，ECOP170还可以催化粪甾醇（4）氧化为粪甾烷酮（3），但不具有转化初级胆汁酸类胆酸和鹅去氧胆酸的能力，表明ECOP170可能在此途径的第一步（胆固醇氧化为胆甾烯酮）和最后一步（将粪甾醇还原为胆固醇）均起特定作用（图3B，3C）。通过qPCR测定ECOP170基因在菌株培养物中的表达水平并将其辅因子偏好性与菌株裂解物中的活性相匹配，证实了ECOP170在胆固醇代谢中的作用。为了确认ECOP170基因确实是在代谢胆固醇的过程中特异表达，分别在含与不含胆固醇的培养条件下，检测四个HSD的转录表达水平。培养2天后，与不含胆固醇的培养基相比，在这四个基因中，ECOP170在含胆固醇的培养基中高表达上调（增加28.9倍），这表明ECOP170确实是在代谢胆固醇的过程中被高度诱导表达。为了确定ECOP170的辅助因子偏好性是否与在E. Coprostanoligenes裂解物中观察到的活性匹配，纯化了带有N端His6-tagged的ECOP170并对其活性进行了分析，发现ECOP170对NADP 有绝对依赖性，对NAD 则无，与在E. coprostanoligenes裂解物中观察到的活性一致。这些数据表明，E.Coprostanoligenes中的ECOP170酶能将胆固醇代谢成胆甾烯酮。借助此信息，用ECOP170 ismA来表示胆固醇转化为粪甾醇过程中起特异作用的阶段和行为。确定IsmA是胆固醇脱氢酶后，再次比对人类微生物组基因目录，找到了含IsmA蛋白簇中的其他蛋白质。这些蛋白质也都有近乎完美的特异性指标，但敏感性指标要低很多，这表明在开始时将蛋白质序列进行分组按优先度排序的有效性。在该蛋白簇中的25种蛋白质序列中，有10种能在NCBI数据库中找到，但都来自不可培养细菌的数据，且仅限于肠道微生物组组装中鉴定到的微生物物种。此外，这10种蛋白质以及其他15种蛋白质都比对不到NCBI数据库中的分离菌株或最近的肠道菌群分离菌株。由上文得出，目前尚无可编码任何IsmA同系物的人类肠道微生物分离菌株，因此研究人员选择了六种不同序列的同系物，用于大肠杆菌中的异源表达和体外生化表征。这六个IsmA同系物在大肠杆菌裂解物中均可将胆固醇氧化为胆甾烯酮，并将粪甾醇氧化为粪甾烷酮。对含IsmA蛋白簇中25个蛋白质序列进行多序列比对，发现严格保守的Ser-Tyr-Lys催化三联体结构是HSD发挥催化活性所必需的，三联体中任何一个氨基酸突变都会导致裂解物中胆固醇氧化活性的完全丧失。这些数据表明，在未培养的人类肠道细菌中发现的IsmA的同系物也是胆固醇脱氢酶，该酶参与人类肠道菌群中粪甾醇代谢的第一步和最后一步（图1）。
图3 E. coprostanoligenes和系统发生地人类相关细菌的未鉴定3β-羟基类固醇脱氢酶将胆固醇氧化为胆甾烯酮
3. 肠道微生物胆固醇脱氢酶是由一支与cluster IV梭菌相关的，常见却不可培养微生物编码合成的 由于在人类微生物组中发现的这25个ismA基因无法比对到任何公开可用的分离菌株基因组上，但其中的10个与宏基因组中组装的物种有关，因此想进一步确定其他15个ismA基因是否也能匹配到未培养的微生物物种上。为此，使用MSPminer将组装好的人类肠道宏基因组分类为宏基因组物种（MSPs），并在这些物种中搜索25个ismA基因。最终有19个成功匹配到MSPs上，将这些MSPs与全范围搜集到的可培养菌株在种水平上进行相似性分类注释，但并未成功，这就表明人类肠道的胆固醇代谢细菌之前并未被表征。为了辅助分类学注释，使用一组单拷贝标记基因评估了所有检测到的MSPs与已分离到的微生物的系统发育关系。在细菌的生命树中，编码IsmA的MSPs和E. coprostanoligenes形成一个连贯的进化枝，位于梭菌聚类群Cluster IV的邻近发育枝上。Cluster IV包括Faecalibacterium prausnitzii，Clostridium Leptum和瘤胃球菌属（Ruminococcus bromii）（图4A），其代谢功能与宿主的健康有关，比如短链脂肪酸的产生。在编码IsmA的MSPs的邻近区域中，有另外9个MSPs。对其基因组草图进行高质量组装进行分析后，发现两个新的编码ismA基因的MSPs（msp_0910和msp_0832），将其添加到进一步的分析流程中。来自msp_0832的ismA基因在非冗余基因目录的原始装配中丢失，这表明通过采用不同的装配技术可能会发现编码IsmA的其他物种。对大多数编码IsmA的MSPs生成高质量的基因组草图（完整性> 90％，污染<5％），全基因组相似性比较分析发现这些MSPs属于不同物种，其最大平均核苷酸相似性为88％。随后将编码IsmA的MSPs的高质量基因组与先前从人类肠道宏基因组中组装的新MSPs进行比较，发现除了两个物种外，其他物种均已在早期报道中进行过分类。为扩大最初的组装覆盖度以更好的搜寻IsmA蛋白，将其他报道中微生物组的数据集也纳入分析中，又鉴定到另外14种IsmA蛋白（50％aa阈值）及其相应的宏基因组组装物种。值得注意的是，当使用常用的基于参考微生物组的分析软件（MetaPhlAn2，MetaPhlAn3和m OTUs_v2）来分析编码IsmA的基因组时，仅匹配到少于四分之一的物种，这说明当前基于参考微生物组分析的局限性。由于缺乏合成粪甾醇的人类肠道分离菌株，研究人员想测试含有编码IsmA的物种的微生物群落是否可以体外合成粪甾醇。为此，在含胆固醇的培养基中对八名健康供体的粪便样本进行厌氧培养4天，在第3天进行宏基因组测序，在第2天和第4天测定胆固醇，胆甾酮和粪甾醇水平。在第4天生成粪甾醇的四个样品中检测到了编码IsmA的细菌，而不生成粪甾醇的样品中则缺少编码IsmA的细菌，这进一步将复杂微生物群落中编码IsmA的细菌与胆固醇代谢联系在一起（图4B）。虽然没有观察到胆固醇到粪甾醇的完全转化过程，但粪便培养物与E. coprostanoligenes的无菌培养物中粪甾醇的含量水平相当，表明在这些特定培养条件限制了其代谢转化。为了解20种编码IsmA物种在人体肠道中的分布，严格按照非冗余基因目录对宏基因组数据集进行了比对，以计算每个数据集中各个物种的普遍性和相对丰度。在用于最初组装的六个队列数据中，编码IsmA物种的平均相对丰度仅为1.4％，而人类微生物组计划2（HMP2）中包含编码IsmA物种的样品百分比为37％， CVON队列中占92％（图4C）。占比最低的两个队列是PRISM和HMP2，这两个队列包含来自炎症性肠病（IBD）患者的大量样本。在这两个IBD队列中，克罗恩病与编码IsmA物种的丰度下降显著相关，表明这些编码IsmA细菌可能对回肠末端炎症敏感（图4D）。在所有六个队列数据中发现的MSPs都可以编码在体外实验表征的IsmA同系物（图4C）；msp_0205，msp_0238和msp_0196也存在于生成粪甾醇的粪便培养物中（图4B）。总之，这些数据支持以下观点，编码IsmA的细菌是人类肠道微生物组的普遍组成部分，它们将胆固醇转换为粪甾醇。
图4 编码胆固醇脱氢酶的肠道细菌是Cluster IV梭菌的未培养成员，在地理上的差异人群中普遍存在 4. 编码IsmA细菌与粪便胆固醇含量的降低和粪便胆甾烯酮和粪甾醇水平升高有关 在完成对编码IsmA细菌的普查后，进一步评估这些细菌在复杂微生物群落中的存在与体内粪甾醇形成的相关程度（图5A）。回到具有成对的宏基因组学和代谢组学数据的两个独立队列，根据其粪便代谢组中是否含有粪甾醇，将样品归类为粪甾醇阳性（转化者）和粪甾醇阴性（非转化者）。在这两个队列中，转化者样品均富含编码IsmA物种（图5B），支持以下假设：肠道微生物组中又编码IsmA细菌，能使群落将胆固醇代谢为粪甾醇。有趣的是，在没有编码IsmA细菌的微生物群落子集中，也发现了粪甾醇生成（图5B）。可能是由于宏基因组测序的检测限导致的这一结果，尤其是微生物处于低丰度情况，或者其他更远进化距离的相关微生物的胆固醇脱氢酶也参与了这一代谢反应。除了编码IsmA细菌与粪甾醇有关，还评估了编码IsmA细菌是否与粪便胆固醇和非靶向代谢组学数据集中鉴定的代谢中间体的水平相关。令人惊讶的是，在PRISM和HMP2队列中，编码IsmA物种的粪便胆固醇降低了75％，而非编码物种的粪便胆固醇降低了55％（图5C）。而粪便中胆甾烯酮的水平相应增加，在这两个队列中，IsmA编码物种的胆甾烯酮含量分别为非编码物种的5.4和3.3倍（图5C）。这些代谢物水平的变化及其与ismA同系物的共现性与之前的假设一致，即编码IsmA的肠道细菌会通过将胆固醇氧化为胆甾烯酮而消耗肠道内的胆固醇，而胆甾烯酮是一种在粪甾醇形成过程中的中间体。为了确定其中形成粪甾醇的粪便样品中胆固醇代谢的程度，使用定量液相色谱-质谱（LC-MS）方法按PRISM队列重新采集了26个样品子集。实验测定的三种代谢物（胆固醇，胆甾烯酮和粪甾醇）的浓度值与之前测定的数据的相对丰度有很好的相关性，从而定量验证了粪便代谢组学数据中我们感兴趣的代谢物。使用粪便样本中每种化合物的绝对浓度，计算出每种样本中粪甾醇，胆甾烯酮和胆固醇的相对比例（图5C）。在11种含粪甾醇的人粪便样品中，粪甾醇在总胆固醇和胆固醇代谢产物（胆固醇，胆甾烯酮和粪甾醇）中占比为7.4％至95.6％，表明体内具有广泛的这一些列代谢活性（图5C）。这11个样品中有7个样品的粪甾醇占胆固醇代谢产物的50％以上。在这7个样品中有3个样品的粪甾醇占胆固醇代谢产物的90％以上。这些数据表明，在某些人中，该途径可能在体内将大多数肠道胆固醇转化为粪甾醇。
图5 粪便中粪甾醇形成与肠道微生物群中胆固醇脱氢酶有关
5. 编码IsmA细菌与低血清胆固醇水平有关 因为编码IsmA细菌与人类粪便样本中的粪甾醇形成和粪便胆固醇水平降低都高度相关，所以研究人员接下来检验了这些生成粪甾醇的细菌是否与人群中血脂水平的变化有关，特别是高密度脂蛋白（HDL）-C，低密度脂蛋白（LDL）-C和总胆固醇（TC）这些指标。研究人员使用了来自三个国家的三项研究中配对的粪便宏基因组学和血清胆固醇测定结果。其中CVON（n = 292）和Jie等人的研究（n = 384）已发表见刊，而FHS队列研究中623名受试者的粪便宏基因组学数据是由作者实验室提供。选定的研究中包括患有CVD的受试者。微生物组中的任何已知的编码IsmA细菌的参与者被分类为编码者，而没有这些物种的参与者被视为非编码者。对以上三项研究进行meta分析，虽然LDL-C或HDL-C均没有统计学上的显著差异，但在编码者和非编码者之间-0.15 mmol/L水平的TC有差异（95％CI：-0.27，-0.03）（图6）。在所有三个研究中均具有方向一致性，且异质性较低（I2 = 0）。关于编码IsmA的细菌对血清胆固醇水平下降的作用幅度，分析发现编码IsmA的细菌（TC浓度为0.15 mmol/L）的作用幅度略微超过了与脂质相关的宿主基因（如HMGCR和PCSK9）的最大作用。由于这些编码IsmA细菌的存在与血清总胆固醇水平的降低在生物学意义上显著相关，因此表明人肠道微生物群的胆固醇代谢会降低宿主胆固醇水平。
图6 Meta分析揭示了CVD人群中总胆固醇水平与编码IsmA细菌状态有关
早在100多年前就有前辈提出过肠道细菌将胆固醇代谢为粪甾醇可能会降低血清胆固醇水平的想法，但对此深入研究相对较少。与其他肠道微生物代谢活动（例如次级胆汁酸形成和短链脂肪酸生物合成）已有大量的研究资讯报道相比，有关胆固醇代谢的研究报道仍特别缺乏。由于难以在人类中培养参与该代谢活动的微生物，且缺乏有关该代谢过程的生化和遗传基础信息，阻碍了人们对肠道细菌胆固醇代谢生物学意义的理解。通过大规模的测序工作，无参考基因组的微生物组分析，以及一套基于体外生化和培养的分析方法，本报道中研究人员鉴定表征了催化粪甾醇生成的第一步和最后一步的肠道细菌酶。实验结果表明，不同人群中大多数粪甾醇的生成可归因于高度普遍的，编码IsmA的细菌种类。这些物种以前没有进行表征且当前还不能进行分离培养，这也是为何一直以来对该代谢途径难以深入研究的主要原因。此外，研究人员还发现粪便样品中粪甾醇形成细菌与粪便胆固醇水平降低显著有关，这为该类细菌能够降低宿主血清胆固醇水平提供了可能的有效机制。同时对三个地理上差异的人类队列数据进行meta分析后得出的结果与上述发现也不谋而合，meta分析结果还表明，肠道菌群中有生成粪甾醇微生物的受试者的总血清胆固醇水平较低。 编码IsmA细菌除了与血清脂质水平变化有关外，还与肠道胆甾烯酮和粪甾醇水平升高有关。出现这一结果值得进一步深入研究，因为这些分子对宿主的影响仍知之甚少。像胆汁酸这样与胆固醇一系列代谢物具有相似化学结构的代谢物，对宿主的代谢和免疫调节有很大的影响，因此，胆甾烯酮和粪甾醇都也可能影响宿主的生物学特征。该研究中针对哪种肠道细菌会参与此反应这一问题，新开发出的分析流程将很好的指导肠道宏基因组数据集的分析，以识别肠道胆固醇代谢在其他生物学现象中发挥的作用。更普遍地说，这项工作强调将肠道微生物的代谢活动与生物体，基因和酶联系起来，以充分了解与人宿主之间的代谢相互作用的迫切需要。 编码IsmA细菌对血清胆固醇的影响大小与与人类基因差异引起的影响大小相当，这表明这些细菌在CVD中具有潜在的保护作用，正如在人类基因变异型所观察到的那样。由于该研究目前的研究队列在统计学上不足以评估CVD风险与肠道微生物组组成之间的联系，因此急需进行大规模的前瞻性研究来探索这一联系。但是，通过对这些人类基因进行治疗性靶向干预会产生较大的效应（针对HMGCR的他汀类靶向药物：平均TC浓度为1.20 mmol/L），因此靶向调节这种微生物途径的反应活性也可能导致相似的效应或额外的治疗效果。通过将可代谢胆固醇的肠道细菌引入人体肠道菌群，或通过增加相应益生元的含量，有可能实现对宿主血清胆固醇的靶向调节作用，这一治疗策略有望影响人类代谢活动的其他领域。 利用整合高通量测序（从头基因组装和代谢组学）和生化知识的多学科策略，找到了肠道微生物组中参与胆固醇代谢的酶。这种相似的挖掘策略也可应用于其他有趣的途径或代谢物中，且无论涉及该代谢的微生物是什么，都能进一步鉴定和表征微生物群主导生物过程中涉及的酶。这对于微生物组研究尤其重要，因为计算分析方法的更新正在不断揭示出全球微生物群落中还未表征的微生物和酶。尽管表征“微生物暗物质”仍然面临巨大挑战，但将生物信息学和生物化学方法结合起来，将有可能使人们找到打开尚未开发的生物学相关代谢转化过程的“钥匙”。 原文链接： https:///10.1016/j.chom.2020.05.013
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