从SARS-CoV-2疫苗的研发历程看疫苗非临床评价

   疫苗非临床评价主要是对产品的质量属性、动物安全性和免疫学等进行评价，以测试疫苗的安全性、有效性，预测接种者在疫苗接种后可能存在的风险，对后续临床试验方案的制定具有指导意义。

  新冠病毒已引起全球约1387万人感染，59万人死亡。近期，我国北京、新疆先后再次出现新冠疫情小范围爆发，其中北京已检测到毒株发生变异。疫苗是防控传染病的唯一、有效手段。疫情爆发以来，全球约200家实验室围绕五条技术路线展开，除16个进入临床外，其余均处于非临床阶段。我国陈薇院士的5-型腺病毒载体疫苗，科兴、武汉所、北京所的灭活疫苗耗时3~4个月陆续完成，结果已在柳叶刀、Science和Cell等期刊公布。

疫苗的临床前研究阶段需要进行哪些研究？即使已经大大缩短了研发时间，但耗时为何依旧如此之长？

本文结合科兴研制的PiCoVacc和北京所研制的BBIBP-CorV新冠灭活疫苗，对WHO公布的疫苗非临床评价指导原则进行解析，以期为疫苗研发提供理论参考（由于两种疫苗已发表的文献篇幅及公布结果有限，实验可能并未完全列出。）。

1.产品工艺过程及质量控制

对疫苗生产用原材料进行质量控制。为保证疫苗质量，整个生产工艺中需严格遵守GMP，按照GMP对原材料质量、纯度、产品添加剂、中间产品等进行质量控制。生产用原材料中，细胞、毒种易受外界环境影响而发生改变。为降低其变化对生产工艺的影响，需按药典要求建立三级细胞库、三级毒种库并定期对其进行检验。

PiCoVacc和BBIBP-CorV疫苗均使用了Vero细胞库。毒种库建立过程中，PiCoVacc疫苗是将患者体内分离到的毒株在Vero细胞上做适应性培养至P10，并对病毒进行测序，发现在P5仅E蛋白发生了A32D突变，主要抗原S蛋白未发生任何变化；BBIBP-CorV疫苗是将患者体内分离到的毒株在Vero细胞上连续传至P7建立原始种子批，并连续传至P10，发现病毒具有良好的遗传稳定性（见表1）。

对中间产品、终产品进行质量控制。疫苗对生产条件高度敏感，因此疫苗质量不能仅通过测试终产品来评价，还需要对中间产品进行质量控制。每种疫苗产品有其特定的质量属性，因此实验室应建立特定方法（生物学实验、理化试验和动物实验等）对疫苗的特定组分、安全性、效力进行检测，以保证各个生产环节的中间产品的稳定性及批间一致性。检测过程中应建立适当的标准品（国际标准品、国家标准品、工作标准品）以控制批间、不同企业间同制品的一致性。

多篇文献报道，新冠病毒表面S蛋白（Spike）主要引起中和抗体，因此疫苗企业评价产品质量时主要通过建立夹心ELISA方法检测S蛋白含量，从而对产品进行质量控制。表1为PiCoVacc和BBIBP-CorV两种新冠灭活疫苗终产品参数。

表1 科兴和北京所新冠灭活疫苗成品主要参数^[3-4]

工艺过程。灭活疫苗生产主要工艺步骤包括细胞培养、病毒培养、病毒收获、浓缩、灭活、纯化等。浓缩、灭活和纯化工艺步骤因企业、病毒特性而异。对比两家新冠灭活疫苗（Vero细胞）工艺流程图及基本工艺参数如图1、表2所示：

 （a）科兴新冠灭活疫苗工艺流程图   （b）北京所新冠灭活疫苗工艺流程图

图1 新冠灭活疫苗工艺流程图^[3-4]

表2 科兴和北京所新冠灭活疫苗基本工艺参数^[3-4]

2. 临床前安全性评价

疫苗进入临床前需在动物体内测试其安全性，以降低临床试验的风险。在进行临床前安全性评价时，需考虑动物品种、免疫剂量、免疫程序、评估实验终点及评估方法等。安全性评价应注意以下几点：

（1）动物品种：远交系品种优先，需选择两种以上的物种以排除动物种属特异性对实验的影响。啮齿类动物一般选择6~8周，兔子选择3~4月；非人灵长类使用量少于啮齿类动物，免疫途径需与临床一致。

（2）免疫间隔：实验中应固定免疫间隔且间隔期应小于临床使用的免疫间隔时间。间隔时间的设置主要参照初次和再次抗体应答时间。由于动物一般在首次接种2-3周后抗体产生并达到稳定期，因此长期毒性试验一般采取2~3周的暴露间隔。实验应使动物最大限度暴露于候选疫苗，且临床试验预计使用的最高剂量组应包含在动物安全性中。

（3）主要监测指标：安全性评价实验主要观察疫苗在动物引起的炎症反应、系统毒性及对免疫系统的影响等。血液及生物指标一般在首次、末次接种后1~3天，及末次接种2-3周后进行；组织病理学检查主要在末次接种及末次接种2-3周后进行。主要监测组织、器官取决于已经上市的疫苗结果，若为新型疫苗需要进行组织全检。

表2两种疫苗安全性评价方案及结果^[3-4]

3.有效性

免疫原性和保护性是评价疫苗有效性的重要指标。免疫原性是指抗原被T、B细胞表面特异性抗原受体识别及结合，诱导机体产生适应性免疫应答的能力，属于侧面分析疫苗激活机体免疫系统反应能力的指标。保护性是动物接种疫苗后进行攻毒实验，是检测疫苗有效性最直接的指标。

免疫原性评估一般涉及对免疫剂量、免疫程序、免疫途径及应答类型等的评估，主要观测血清阳转率、GMT及细胞应答水平，从而为临床试验方案的设计及预期结果提供参考。灭活疫苗通常以体液免疫为主，产生的抗体有中和、清除病原微生物及其产生的毒素作用，对细胞外感染的病原微生物有较好的保护效果。但动物和人的免疫应答具有一定的差异性，动物的免疫原性评估结果不能完全反应人体的免疫应答水平。

PiCoVacc和BBIBP-CorV两种新冠病毒灭活疫苗均从免疫途径、免疫剂量、免疫程序等多方面，以抗体水平为主要评价指标，对疫苗免疫原性进行评价，具体内容见下表3。

表3 两种疫苗免疫原性方案及结果^[3-4]

      保护性实验通常是将动物分为两大组（一组为安慰剂，另一组接种疫苗），并在一定时间后对动物进行同剂量的攻毒实验。监测动物体内病毒载量、组织病理特征变化及死亡率等，以判断疫苗是否能显著降低病毒载量、减轻病理特征、降低动物死亡率，从而判定疫苗的保护性。PiCoVacc和BBIBP-CorV在恒河猴体内的保护实验结果如下：

表4 两种疫苗保护性实验结果^[3-4]

4. 其它

疫苗的非临床评价内容依据疫苗的种类、是否有已上市疫苗以及疫苗研发过程、疫苗终产品的成分等情况而定。若疫苗添加了新型佐剂、防腐剂等，制品相应的评价项目会随之增加。疫苗产品成分的更改，也需要相应的临床前评价，具体内容应参照WHO、药审中心的官方文件。

写在文末

本篇内容是小编业余时间根据兴趣写的一个话题，文章涉及的关于新冠病毒灭活疫苗的数据均来源于已发表在Science和Cell上的文章，主要目的是通过呈现两家企业研发新冠疫苗的历程，多角度、多方面为大家呈现灭活疫苗的临床前研究需要哪些步骤、实验等，仅供参考。各家企业都有自己的核心技术及研发技术优势，产品各有特色，让我们共同期待这些疫苗早日上市，造福人类。

参考文献

[1]  https://www./publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines.

[2] WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines.

https://www./biologicals/vaccines/nonclinial_evaluation_of_vaccines/en/.

[3] WANG H, ZHANG Y, HUANG B, et al. Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2 [J]. Cell, 2020.

[4] GAO Q, BAO L, MAO H, et al. Rapid development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2 [J]. Science, 2020.

[5] 刁连东、翟如芳.疫苗安全与问答[M]2017.