TME文献精读 | 局部免疫环境能够决定肿瘤PD

大家好，今天和大家分享的是19年发表在The Journal of Clinical Investigation杂志上的一篇关于肿瘤免疫微环境的文献。标题的大致含义是“局部免疫环境能够决定肿瘤PD-L1的异质性，进而影响肿瘤对免疫治疗的敏感性”。
在背景部分，作者指出：
PD-L1在难治性肿瘤的治疗方面是一个很有潜力的靶点。然而，PD-L1+肿瘤的免疫环境及肿瘤的特点，以及它们影响治疗效果的机制目前还不清楚。
在本项研究中，作者通过对32种肿瘤类型的9769名患者的基因数据进行分析，发现患者局部免疫情况可以决定PD-L1的异质性与肿瘤生物特征，并进一步影响患者临床结局。
接下来，是文章的结果总览，文章大致可以分为表型、机制和药物治疗三部分：图1和图2对应表型部分，图1说明PD-1与多种肿瘤的免疫特征相关，图2 说明高表达PD-L1的肿瘤免疫环境决定了患者的临床结局；图3、4、5、6对应文章第二部分，阐述了肿瘤巨噬细胞和T细胞分别通过不同的途径，诱导癌细胞PD-L1；图7、8则对应文章的第三部分，图7说明两种不同方式诱导产生的PD-L1 +肿瘤细胞对免疫治疗的反应不同，图8说明免疫检查点阻滞治疗联合NF-κB通路抑制能有效地抑制肿瘤生长。
接下来，是文章的数据部分：

图1主要阐述的内容是：PD-L1反映了人类多种肿瘤的免疫特征

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图A是对345名肝癌患者的PD-L1和IFN-γ相关性进行分析的结果。其中蓝色代表PD-L1,红色代表IFN-γ。以IFN-γ为例，可以看到随着IFN-γ表达的升高，PD-L1表达并没有随之升高，反之亦然，从而说明高表达IFN-γ的组织并不伴随PD-L1的高表达。
图B是对TCGA数据库32种肿瘤的9138名患者的RNA-seq数据进行分析，其中27种类型IFN-γ与PD-L1没有相关性或为弱相关。
图C是将32种癌症样本中的9138例患者按每种肿瘤内PD-L1或IFN-γ表达的平均值分为两组。发现只有极少部分的高表达PD-L1的样本同时呈现IFN-γ高表达的特征

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图D是对来自TCGA数据集的肝癌样本中进行分析，发现肝癌组织中有53种基因与PD-L1表达相关，进行GO分析发现4条富集程度较高的通路与肿瘤坏死因子或白介素-1特征相关（图1D）
图E是基因富集分析的结果，进一步证实了与IL-1和TNF特征相关的基因主要富集在PD-L1高表达的肝癌组织中

图2主要阐述的内容是：高表达PD-L1肿瘤的免疫微环境决定了患者的临床结局

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图A是在TCGA的32种癌症样本中，分析了9138例患者PD-L1与相应基因之间的相关性。
其中巨噬细胞标记物CD68和T细胞标记物CD3基因与PD-L1存在相关性，说明PD-L1与巨噬细胞和T细胞的浸润相关
图B是分析肝癌组织中国巨噬细胞和T细胞密度与PD-L1表达的相关性。可以看到巨噬细胞或（和）T细胞聚集在PD-L1高表达的肿瘤组织内
图C是肝癌组织中共聚焦显微镜分析，绿色代表PD-L1 +细胞、红色代表CD68 +巨噬细胞和白色代表CD3 + T细胞
图D反映的是结肠癌 (n = 82)、胃癌(n = 78)和肺腺癌 (n = 89)组织中PD-L1表达水平高低与巨噬细胞和T细胞的密度的关系。黑色代表PD-L1低表达，红色代表PD-L1高表达
由此可得巨噬细胞、T细胞聚集在PD-L1高表达的肿瘤组织内

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图F是单变量回归分析说明巨噬细胞与T细胞比例是HCC侵袭性的独立预测因子

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图E是左侧图根据PD-L1在肿瘤中的表达将276例HCC患者分为两组:红色，低表达黑色高表达，可以看到两组在复发率上没有明显的区别;在右侧图中将138例CD274高表达患者按肿瘤中巨噬细胞与T细胞的比例进一步分为4组:橙色代表，比值值> 2,n = 39;绿线，比值介于1和2,n = 30;紫色线，比值介于0.5和1,n = 31;蓝线，比值小于0.5，可以看到
患者的复发与PD-L1是否高表达并无关系，而与巨噬细胞和T细胞的浸润比例有关，比值越高复发的可能性越大
图H是在肺腺癌（LUAD）、肠腺癌（COAD）、胃腺癌（STAD）进行的重复验证得到的结论与图3E相同

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根据肿瘤中巨噬细胞与CD3 + T细胞的比例将CD274例高级别患者分为4组
A图显示肝癌中四个组PD-L1表达差异，BCD分别显示结肠癌、胃癌、肺腺癌中不同分组PD-L1表达差异。可以各组之间PD-L1表达水平无明显差异，与正文图2 E、H呼应，排除PD-L1表达水平对患者临床结局的影响
图3主要说明的是：肿瘤内巨噬细胞和T细胞均能诱导PD-L1肿瘤细胞

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图A和B是在NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠接种25天前后，肝癌组织中PD-L1的表达观察到在免疫缺陷环境下，PD-L1+的肿瘤细胞几乎消失

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图C和图D是对人类肝癌细胞系采用不同的培养条件培养，得出的结果
将肝癌细胞系细胞Hep3B、Huh7、HepG2暴露于肿瘤白细胞培养的条件培养基(CM)中，PD-L1快速上调，在3天内达到最高值，移除CM后逐渐下降

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图E和图F是用分为T细胞来源、巨噬细胞来源、B细胞来源等条件培养基分别处理肿瘤细胞后观察癌细胞PD-L1表达，发现与正常培养相比，培养过T细胞的培养基（T-cell-CM）或肝癌来源的巨噬细胞的培养基（TAM-CM）能使肿瘤细胞在增殖时产生PD-L1表达的肿瘤细胞

图4主要说明的是：巨噬细胞和T细胞诱导表达PD-L1肿瘤细胞的方式不同

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图A是未经过处理、T细胞的培养基（T-cell-CM）处理、巨噬细胞的培养基处理后HepG2细胞蛋白表达情况
从中可以看到T-cell-CM能激活肝癌细胞表达STAT1；TAM-CM能强烈激活肝癌细胞表达STAT3。

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图B是加入抑制剂后的回复实验结果，说明加入NF-κB通路抑制剂后巨噬细胞诱导PD-L1表达 下降,而阻断STAT1信号通路T细胞诱导的PD-L1表达下降

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图C和图D是对巨噬细胞和T细胞诱导表达PD-L1上游机制的研究，说明阻断巨噬细胞分泌的TNF-α或IL-1β后，可以阻断下游NF-κB通路的激活，抑制肿瘤PD-L1表达

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图E是PD-L1的 肿瘤细胞体外培养或在免疫功能正常的小鼠表达情况。
图F和G是敲除 NF-κB通路中P65或阻断IFN-γ受体表达后癌细胞中PD-L1的表达在肿瘤组织中的表达。

图H和I是注射抗T细胞标记物CD3抗体和抗集落刺激因子1抗体后，肿瘤细胞PD-L1表达情况
这一部分说明肿瘤免疫微环境中，巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-1β被肿瘤细胞表面相应受体识别，引起NF-κB通路激活，诱导PD-L1表达；T细胞分泌干扰素γ，与肿瘤细胞表面受体结合引起信号通路激活，诱导PD-L1表达。

图5主要说明的是：巨噬细胞和T细胞诱导PD-L1 +癌细胞具有特异的肿瘤特征

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图A、B、C是对比了两种来源的PD-L1阳性肿瘤细胞的凋亡、细胞迁移表型：图A是在血清饥饿条件下肿瘤细胞中凋亡相关的蛋白的表达不同，图B是凋亡细胞数目，说明T-cell-CM培养过的HepG2细胞在血清饥饿条件下更易凋亡；图C对比肿瘤细胞迁移能力，说明TAM-CM处理过的HepG2细胞更易发生迁移；

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图D和图E对比了肿瘤细胞上皮细胞-间充质转化能力，说明巨噬细胞诱导的PD-L1 +肝癌细胞选择性表达波形蛋白，E-钙黏蛋白减少，更容易发生提示上皮-间质转化(EMT)

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图F是分析巨噬细胞诱导的PD-L1 阳性肿瘤细胞与未诱导的肿瘤细胞，致癌基因mRNA水平的变化，可以观察到EFNA1、 ITGB3、EFNB2等生长因子及受体基因、IL8、THBS1、CDH5等粘附分子基因、TNFAIP2等蛋白酶、SPHK1、PTGS1等转录因子基因、TNF、IL6等细胞因子基因的mrna水平相对于未经巨噬细胞处理的癌细胞含量升高

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图G是TCGA数据集肝癌样本中巨噬细胞比T细胞比例高的样本与比例低的样本血管生成特征、转移特征和上皮-间质转化基因富集分析。发现巨噬细胞诱导的PD-L1 +肝癌细胞中促血管生成、转移、上皮-间质转化基因的表达上调，说明巨噬细胞赋予癌细胞生存、迁移和血管生成的能力。

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接下来作者在TCGA数据集结肠癌、胃癌、肺腺癌样本中进行重复验证，CD68/CD3E高比例样本中与血管生成特征、转移特征和EMT样特征的基因集富集，说明在高表达PD-L1的HCC、COAD、LUAD和STAD肿瘤中，EMT、转移和血管生成的基因选择性富集

图6主要说明的是：巨噬细胞诱导产生的PD-L1肿瘤细胞通过NF-κB通路变得更具侵袭性

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图A是细胞迁移实验，通过添加通路阻断剂和rna干扰下调P65表达后，观察肝癌细胞迁移能力，其中siNC组作为rna干扰的阴性对照组，DMSO作为药物溶剂，设置该组作为对照
图B是经过图A处理后，观察与上皮-间充质转化相关的基因转录水平改变
图A、B说明通过抑制NF-κB通路或抑制P65表达后肝癌细胞的迁移下降和上皮-间质转化表型受到抑制

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图C是癌细胞接触肿瘤坏死因子α和白介素1β后观察STAT1通路和NF-κB通路蛋白磷酸化改变，可以观察到癌细胞接触坏死因子α和白介素1β后，p65发生磷酸化；接触干扰素γ后，stat1发生磷酸化
图D是免疫荧光实验，可以观察到癌细胞接触肿瘤坏死因子α和白介素1β后细胞核内出现P65代表的红色，说明发生P65入核，进一步说明NF-κB通路被激活
图C和D说明癌细胞接触TNF-α和IL-1β后，激活NF-κB通路，导致肝癌细胞的迁移和上皮-间质转化能力增强
图E、F、G与图A、B设置类似，说明的是癌细胞接触TNF-α和IL-1β后，迁移增强和上皮-间质转化能力增强

图7主要说明的是：不同方式诱导产生的PD-L1+的肿瘤细胞对治疗的反应不同

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图A对比肿瘤细胞对阿霉素反应，可以看到同等药物浓度下，巨噬细胞诱导的PD-L1阳性肿瘤细胞凋亡程度最低，而图B、C中通过抑制NF-κB通路或调低P65 NF-κB亚基表达则能提高凋亡细胞的比例

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图E对比肿瘤细胞对T细胞杀伤作用的抵抗能力，我们用直接从小鼠Hepa1-6肝癌中分离的CD8 + T细胞培养这些细胞。未经过巨噬细胞诱导处理的肿瘤细胞与CD8 + T细胞接触3至6小时后，被杀灭。转染PD-L1的Hepa1-6细胞可以部分抵抗T细胞的细胞毒性，但这个过程通过抗PD-L1抗体而被阻断。巨噬细胞诱导产生的PD-L1 +肝癌细胞能抵抗 T细胞的细胞毒性

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图F和图G是检测与肿瘤细胞接触后CD8 + T细胞的功能状态。图F说明T细胞接触三种不同途径产生的PD-L1阳性肿瘤细胞后IFN-γ 、IL-2水平相当，图G显示T细胞标志物CD107a表达。两图共同说明巨噬细胞生成的PD-L1 +肝癌细胞对T细胞的细胞毒性具有抵抗能力，但不抑制CD8 + T细胞的功能。

图8主要说明的是：抑制巨噬细胞激发NF-κB通路能提高免疫检查点抑制剂的阻滞效果

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图A和B探究的是巨噬细胞产生的PD-L1+肿瘤细胞对免疫治疗产生的影响，将 PD-L1阳性鼠源性肝癌细胞接种到老鼠肝脏，使用抗PD-L1抗体，抗巨噬细胞标记物抗体处理，分析肿瘤大小，结果发现抗PD-L1抗体联合巨噬细胞清除能有效抑制肿瘤组织的增殖（图10A和10B）。
图C和图D与A、B设计类似，说明抗PD-L1抗体联合抑制P65表达，能起到同样的抑制效果。

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补充材料中，黑色素瘤接种小鼠背组织后经过抗CSF1R ,αPD-L1 或αCSF1R Ab +αPD-L1 Ab处理后，观察肿瘤体积大小，图B是经过处理后肿瘤大小，可以看到免疫检查点阻滞治疗联合体内巨噬细胞清除能有效地抑制肿瘤生长

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图E、F说明的是肝癌、肺腺癌（LUAD）、肠腺癌（COAD）、胃腺癌（STAD）中巨噬细胞标记物CD68与NF-κB 通路活化、肿瘤复发正相关， 因此通过抑制巨噬细胞在肿瘤细胞中的浸润或抑制NF-κB信号，可以增强免疫检查点的治疗效果

主要结论

由巨噬细胞促炎反应导致NF-κB信号通路激活产生的PD-L1+肿瘤细胞表现出侵袭性生存、促血管生成、转移等特点
由激活T细胞所产生的STAT1信号则会导致PD-L1+肿瘤细胞的凋亡。
由此导致的重要结果是，由巨噬细胞所建立的PD-L1+肿瘤细胞对传统化疗、肿瘤特异的效应T细胞的细胞毒性作用、免疫检查点阻滞疗法效果不佳。
而免疫检查点阻滞治疗联合体内巨噬细胞清除（或NF-κB通路抑制）能有效地抑制肿瘤。
本研究揭示了PD-L1+肿瘤的功能特点，并提示对炎症细胞的功能活动施加影响能提高肿瘤检查点阻滞疗法的疗效。

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