【文献解读】文献143：局部免疫环境决定肿瘤PD-L1异质性及对治疗的敏感性

The local immune landscape determines tumor PD-L1 heterogeneity and sensitivity to therapy

The Journal of Clinical Investigation

背景

• PD-L1在难治性肿瘤的治疗方面是一个很有潜力的靶点。然而，PD-L1+肿瘤的免疫环境及肿瘤的特点，以及它们影响治疗效果的机制仍需探索。

• 该项研究通过对32种肿瘤类型的9769名患者的基因数据进行探索，发现PD-L1并不能代表IFN-γ的特征，而是潜在的预示了肿瘤内促炎髓系反应。局部免疫情况赋予的PD-L1的异质性与肿瘤生物特征和患者的临床结局相关。由巨噬细胞促炎反应导致NF-κB信号通路激活产生的PD-L1+肿瘤细胞表现出侵袭性生存、促血管生成、转移等特点，而由激活T细胞所产生的STAT1信号则会导致PD-L1+肿瘤细胞的凋亡。由此导致的重要结果是，由巨噬细胞所建立的PD-L1+肿瘤细胞对传统化疗、肿瘤特异的效应T细胞的细胞毒性作用、免疫检查点阻滞疗法效果不佳。而免疫检查点阻滞治疗联合体内巨噬细胞清除（或NF-κB通路抑制）能有效地抑制肿瘤。本研究揭示了PD-L1+肿瘤的功能特点，并提示对炎症细胞的功能活动施加影响能提高肿瘤检查点阻滞疗法的疗效。

材料与方法

材料

• 组织样本由中山大学肿瘤防治中心采集并经病理学证实，包括肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌，共计631名患者。所有患者在组织采样时均未接受抗肿瘤治疗，并排除自身免疫性疾病、HIV、梅毒。此外，从2015年12月至2018年12月间接受手术的37名肝癌患者取组织及配对外周血，用以分离肿瘤浸润性白细胞。其他有完整随访数据的样本则用以分析复发情况。临床分期依据AJCC标准进行判定。

• 体外实验部分包括人源肝癌细胞系Huh7、Hep3B、HepG2，鼠源肝癌细胞系Hepa1-6、B16-F10。

• 动物实验包括野生型雌性C57BL/6小鼠，NOD SCID小鼠。

方法

免疫组化和免疫荧光、肿瘤内白细胞的分离和培养、流式分析、蛋白印迹、real-time PCR，肿瘤细胞种PD-L1的表达调节、病毒载体构建及PD-L1稳转细胞系构建、RNA干扰、细胞迁徙实验、动物实验、统计分析。

结果

结果-1、PD-L1反映了人类肿瘤的多种免疫特征

图1 PD-L1反映了人类肿瘤的复杂免疫特征

• 对345名肝癌患者的PD-L1和IFN-γ相关性进行分析，IFN-γ高表达的组织并不伴随PD-L1的高表达（图1A）。对TCGA数据库32种肿瘤的9138名患者的RNA-seq数据进行分癌肿的相关分析，其中27种类型IFN-γ与PD-L1没有相关性或为弱相关（图1B）。在进一步对PD-L1和IFN-γ的表达高低进行二分类研究时，只有极少部分的PD-L1 高表达的样本同时呈现IFN-γ高表达的特征（图1C）。

• 肝癌组织中有53种基因与PD-L1表达相关，进行GO分析发现4条富集程度较高的通路与促炎TNF或IL-1特征相关（图1D），利用基因富集分析（GSEA）证实，与IL-1和TNF特征相关的基因主要富集在PD-L1高表达的肝癌组织中（图1E）。

结果-2、PD-L1高表达的肿瘤免疫景观决定了患者的临床结局

图2 T细胞、巨噬细胞与PD-L1的相关性

• 对32种肿瘤中PD-L1高表达的样本进行分析，PD-L1特征潜在反映了巨噬细胞和T细胞的浸润（图2A），对收集的组织切片进行免疫组化和免疫荧光染色并计数，巨噬细胞或（和）T细胞聚集在PD-L1高表达的肿瘤组织内（图2B）。

图3 PD-L1高表达肿瘤的免疫特征影响患者临床预后

• 在接受手术治疗并有随访记录的276名肝癌患者中，患者的复发与PD-L1是否高表达并无关系，而与巨噬细胞和T细胞的浸润比例有关，比值越高复发的可能性越大（图3E）。多元回归分析也证实该比值是预测侵袭性肝癌患者临床预后的独立危险因素（图3G）。

• 在肺腺癌（LUAD）、肠腺癌（COAD）、胃腺癌（STAD）（患者数分别为89、82、78名）中再次得到与图3E相同的结论（图3H）。

结果-3、肿瘤内巨噬细胞和T细胞能以不同的方式诱导表达PD-L1的肿瘤细胞

图4 肿瘤内巨噬细胞和T细胞均能诱导PD-L1肿瘤细胞

• 大部分肝癌患者的组织中均表达PD-L1，但表达量各不相同，当把这些组织接种到NOD SCID小鼠中时，发现在免疫缺陷环境下，PD-L1+的肿瘤细胞几乎消失（图4 A和4B），对人类肝癌细胞系采用不同的培养条件培养，也得出相似的结论（图4C和4Ｄ），进一步探索发现，与正常培养相比，培养过T细胞的培养基（T-cell-CM）或肝癌来源的巨噬细胞的培养基（TAM-CM）能使肿瘤细胞在增殖时产生PD-L1表达的肿瘤细胞（图4 E和4F）。

图5 肿瘤内巨噬细胞和T细胞诱导表达PD-L1肿瘤细胞的方式不同

• 进一步研究表明，T-cell-CM能强烈激活肝癌细胞STAT1；TAM-CM能强烈激活肝癌细胞STAT3。

结果-4、巨噬细胞和T细胞所诱导产生的PD-L1+肿瘤细胞具有不同的特征

图6 T细胞和巨噬细胞通过不同的方式诱导PD-L1+肿瘤细胞

• 构建稳定表达PD-L1的HepG2细胞系（图6 transfected所示），在血清饥饿条件下肿瘤细胞中表达的蛋白不同（图6A），T-cell-CM培养过的HepG2细胞在血清饥饿条件下更易凋亡（图6B），TAM-CM培养过的HepG2细胞更易发生迁移（图6C）。

图7 巨噬细胞和T细胞诱导的PD-L1肿瘤细胞具有不同的肿瘤特征

• 对HCC、COAD、LUAD 3种肿瘤组织样本进行GSEA分析，巨噬细胞/T细胞值较高的组织更易出现血管增殖、转移、上皮细胞-间质细胞转换（EMT）样的特征（图7）。

图8 巨噬细胞诱导产生的PD-L1肿瘤细胞通过NF-κB通路变得更具侵袭性

• 抑制NF-κB通路或调低P65 NF-κB亚基（siRELA）表达能抑制肝癌细胞的迁移（图8A），而IFN-γ不激活NF-κB通路，也未对肿瘤的侵袭特征有显著影响（图8C-8F）。

结果-5、不同方式诱导产生的PD-L1+的肿瘤细胞对治疗的反应不同

图9 通过不同方式诱导产生的PD-L1+肿瘤细胞对治疗的反应不同

• 在分析过PD-L1+肿瘤细胞的调节、免疫环境、功能特征后，进一步研究了这些细胞对治疗的反应。已知阿霉素（dox）在0.25 μg/mL时即能产生抗瘤效应，在（0.25-1） μg/mL时，TAM-CM培养下的HepG2肿瘤细胞凋亡程度明显较低（图9A），而抑制NF-κB通路或调低P65 NF-κB亚基表达则能提高化疗的杀伤效果（图9B和9C）。

结果-6、抑制巨噬细胞激发NF-κB通路能提高免疫检查点抑制剂的阻滞效果

图10 抑制巨噬细胞激发NF-κB通路能提高免疫检查点抑制剂的阻滞效果

• 为了探究巨噬细胞产生的PD-L1+肿瘤细胞是否会对免疫治疗产生影响，本研究利用C57BL/6小鼠和稳定表达PD-L1的鼠源肝癌细胞hepa1-6构建了肿瘤动物模型，并给予PD-L1抑制剂，联合巨噬细胞清除（αCSF1R）能有效抑制肿瘤组织的增殖（图10A和10B）。并且，调低P65 NF-κB亚基表达也能起到同样的抑制效果（图10C和10D）。

结论与讨论

• 肿瘤内的免疫环境与肿瘤的发生发展密切相关，该研究证明了PD-L1+肿瘤免疫特征的复杂性能够影响肿瘤特征、治疗效果及患者临床结局。

• 肿瘤组织PD-L1的表达并不影响患者的复发，而PD-L1高表达的肿瘤组织内巨噬细胞和T细胞的比例的增高则预示了患者更早的复发。针对巨噬细胞高浸润的患者使用免疫检查点抑制剂是否合适，该如何选择更为合适的治疗方案，这些问题则需要进一步的探索。