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懒人必读： 按专家建议的protocol来做ACMG分级 最近，wiley旗下Current protocols in human genetics杂志刊印了刊载了来自上海交通大学和哈佛大学医学院等机构的临床遗传变异解读实验室指南。工作由上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院张军玉副研究员、湖北省妇幼保健院姚妍怡副主任医师、山东大学齐鲁医院何海贤医师和哈佛医学院布莱根妇女医院Jun Shen教授共同完成。 文章内容非常详细，涉及常用参考数据库，位点命名术语，各项证据的使用等方面。 估计关注我这个号的基本上都是沉迷于分级的小伙伴，所以本着实用主义精神，我们就快速的看看这篇文章对于我们位点ACMG的分级有哪些详细指导。仅代表我自己的一些想法，也欢迎各位专家的建议指导。 ACMG的位点分级流程 因为文章内容比较详细，所以我们还是按照常规ACMG划分，从致病性往良性这样的顺序开始做一些解读。
A PVS1的使用前提是已知功能丧失（LOF loss of function）变异是该基因的致病机制。 在这一大前提下，我们才可以使用PVC这样一条证据，为了判断功能丧失型变异是否是该基因的致病机制，我们可以参考gnomad数据库当中的PLI值,一般认为CPI值大于0.9，功能丧失型变异是该基因的致病机制。但小心存在一些特殊情况，例如以BRCA1为例，该基因PLI值为零, 因为该基因与卵巢癌，乳腺癌相关，而卵巢癌，乳腺癌与生殖年龄相关。 B 当确定一个基因上功能丧失型变异是它的致病机制之后，我们需要判断变异是否导致了NMD。NMD的判断，我们在之前讨论PVS1使用之中已经讲过，可以参考。（ClinGen中PVS1证据的应用指南） 针对PVS1的应用，有很多公司开发出相关的软件，华大基因开发的auto PVS1可以参考，最好还是自己再做一轮质控，软件可以参考。
PS1针对的是错义突变，这里需要强调的是，PS1针对的是同一氨基酸，不同核苷酸的变化;而如果是同一氨基酸位，不同氨基酸的改变，那么这个时候使用PM5。这里一定要强调是同一个氨基酸，不同核苷酸，才能用PS1。
PS2的使用前提是基于家系当中的新发突变。如果没有经过家系验证，只能使用PM6。在这里需要注意的是，如果有可靠文献当中报道过的新发突变。即使针对当前先证者没有做过家系验证,我们一样的可以使用PS2。 我的补充：如果做的是核心家系作诊断，建议在开始做分析之前就会针对家系的血缘关系（IBD,Identification by descent)做一轮计算，这样检出的新发突变可以使用PS2。
PS3强调经过严格的对照实验发现，变异本身对于基因功能的影响。可以根据实验结果进行证据的升降级。在这里需要注意：体内功能实验提供的证据可信度要强于体外功能实验。
PS4的定义是位点频率在患者组当中的分布高于对照组。为了做数据的量化，在这一边给出了一些详细的参考值。OR值大于5,在做这方面的比对时，本地数据库的价值要优于Gnomad数据库。
PM1仅针对错义突变Indel，是否位于热点区域，可以参考gnomad的数据库当中针对错义变异的o/e值。这里本该有一个推荐值，但是目前clingen并没有给出一个相应的cutoff值。
PM3强调隐性遗传致病基因下，与另外一条P/LP共同构成反式位点的变异,适用于PM3证据。 一个疑惑： 如果某一VUS变异和另一个LP（缺PM3证据）位点互为反式，此时当前变异适用于PM3，分级可以由VUS提升至LP。之前缺乏PM3的LP变异是否可以加上PM3提升至Pathogenic。PM3这样一条证据是否存在过度使用的问题？希望各位专家不吝赐教。
针对的是框内插入缺失变异,我们需要注意indel是否位于动态重复区域，查阅动态重复区域，我们可以跳转至UCSC基因组浏览器。在Repeated masker track进行查看。当然，现在有优秀的商业化软件（插播：我自己用的TGex，Tgex.genecards.cn）在注释时会提醒indel位于重复区域。 PP1 考察的是家系共分离的证据。按照ClinGen的指南我们把PP1证据的强弱分为PP1,PP1_moderate以及PP1_strong，划分具体PP1等级的，由家系共分离分数来决定。分数值分别为0.6，1.2，1.5，具体的计算分数由以下公式来决定：
一般来说家系中共分离的次数等于患者个数减一。 注意以下情况：常染色体显性遗传或x连锁遗传情况下，分离的次数需要计算先症者的分离个数，以及的携带者分离次数；而针对隐性遗传病，我们则需要去查看患者的个数以及患者的同胞当中的携带者的分离次数。
PP2与BP1 这是针对错义突变的一个预测标准，如果错义突变是基因的主要致病机制，那么发生错义突变时适用于PP2证据。此处我们参考Gnomad数据库当中的z值，它是针对错义突变的一个预计值，z值大于3.09，我们认为有可能错义突变是基因的一个主要致病机制，该基因错义突变适用于PP2。 某软件中整合的PLi值、Z值信息：
而与之相对应的则是bp1证据，bp1代表错义突变不是该基因的主要致病机制。在这边我们主要参考ClinVar当中P/LP的位点。如果ClinVar当中百分之九十的致病性变异都是截断型的变异，如果该基因上发生了错义突变，适用于BP1。
PP3与BP4 针对PP3证据,指的是多个预测软件提示该变异有害。针对错义突变，我们主要参考REVEL当REVEL大于0.75，我们认为该变异是致病性的，如果REVEL小于0.15，那么我认为它可能是良性的，适用于BP4。针对剪切位点也有很多预测软件。
当基因与表型高度吻合适用于PP4。 注意PP4的使用不应局限于单一遗传病因的疾病。
PP5 PP5已于2018年废止。但是目前仍有实验室会参考这一信息。 我自己其实不会把PP5列到ACMG分级的证据里面，但是如果ClinVar中有相关信息，我会选择性的结合位点的review states,针对性的选择使用PS1或者PM5证据，但是分级结果中，这条证据不体现。
纯混字数： 以上是我的一些总结性的内容，基本上挤干了水分，如果各位老师对原文感兴趣，可以参阅：doi: 10.1002/cphg.98。如果有愿意普渡遗传学众生的活菩萨，也可以直接把一些相关结论直接贴在评论下方，我也会定时更新到解读方面的文章里面。 最后感恩各位家人，给各位老板磕头啦~  |
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