基因组非编码区变异的临床解读建议（中）

将ACMG/AMP指南应用于非编码区变异

虽然ACMG/AMP指南的主要考虑是蛋白质编码区变异的解释，但它们的目的是包罗万象的，可以适用于全基因组的变异解释。因此，这些建议旨在与现有的指南并驾齐驱，读者应注意到对这些规则的调整而不是取代。

Richards等人的许多规则可以直接应用于非编码区的变异，而不需要额外考虑（图3）。这些规则包括使用频率信息（BA1、BS1、BS2和PM2），对确认的新发变异进行加权处理（PM6和PS2），以及纳入共分离证据（PP1和BS4）。相反，一些规则不适用于非编码区变异，例如那些专门指失义变异的规则，在此不做进一步调整（PP2和BP1）。

对于ACMG/AMP的九条具体规则，我们建议对其使用方式进行一些修改（例如降低强度以反映较低的确定性），或注意在激活时的额外考虑（图3；附加文件1：表S3）。下文将详细讨论其中的每一项。

PVS1

最初的ACMG/AMP指南和更新的指南都没有提到除经典剪接位点变异以外的非编码区变异，或者会删除一个或多个外显子的剪接缺陷，因为在没有实验数据的情况下，不能有把握地预测非编码区的大多数变异会导致无效影响。鉴于此，我们不建议将PVS1用于现有指南未涵盖的变异类型。我们还提醒，PVS1不应该应用于UTR内的经典剪接位点，因为其下游影响并不明显是功能丧失。此外，PVS1不应与计算预测工具结合使用（规则PP3），正如以前的指南中对典型剪接变异所规定的那样。

尽管PVS1经常被应用于典型的剪接位点变异，但我们提醒，这些变异并不总是有无效的影响；尽管变异对剪接后的转录本造成了变化，但替代性剪接等因素可能介导这些变异的致病影响。此外，破坏剪接的变异可能会产生多重影响和/或仅产生部分影响（参见下面的指南），一些异常剪接的转录本会导致功能丧失，而另一些则没有显示出明显的变化或产生功能性转录本。在这种情况下，这些后果会得到不同的解释，每个转录本的相对剂量是一个重要的考虑因素。

PM1

值得注意的是，非编码区的序列约束和变异效应已被证明可能是碱基特异性的，而不是在更大的区域中保持一致。因此，仅仅因为一个区域（如UTR，或顺式调控元件）内的多个变异被证明是致病的，就激活PM1是不合适的。然而，在某些情况下，应用PM1可能是合适的；例如，当一个变异破坏了一个转录因子的结合区域，而该转录因子的扰动已被反复证明是致病的，或者多个已知的致病变异聚集在同一明确的增强子区域内，如控制SHH表达的ZPA调节序列（ZRS）的子区域。但是，在这些情况下，我们建议始终将 PM1 的强度降低到Supporting。

在给定的破坏已知转录因子结合位点的例子中，如果这是用计算工具预测的，那么这应该适用PP3，而不应该同时用于PM1。

PS1

在ACMG/AMP指南中，PS1专门用于错义变异，当不同的核苷酸变化导致的氨基酸变化与已确定的致病变异相同时。英国ACGS随后的指南指出，PS1也可用于'用于剪接变异降级为Supporting，即不同的核苷酸替换已被归类为（可能的）致病性变异，并且被评估的变异被计算工具预测为对mRNA/蛋白功能有类似或更大的有害影响。虽然我们支持对PS1的这种使用，但我们也提醒，不同的碱基变化对替代剪接位点的激活会有不同的影响，因此可能会产生不同的影响。在其他一些特定的场合，应用PS1也可能是合适的，例如，uORF终止变异，先前已证明同一终止密码子的破坏是致病的。

PM5

在此，我们建议使用这个证据代码来评估非编码区变异，这些变异被预测为对同一基因有完全相同的影响，与已确定的致病变异一样，但本身可能以前没有被描述过。这方面的例子包括上游起始密码子产生的变异导致out-of-frame的开放阅读框（参见下面的 NF1 示例管理），以及相同转录因子结合位点或启动子区域的几乎完全重叠的缺失。

一般来说，PS1应该用于与先前致病性变化相同的碱基或残基受到影响的情况，而PM5应该用于具有相同预测效果的其他变异，但不在相同的特定碱基/残基上。如果变异的影响是用计算工具预测的（如剪接区变异），那么这个信息应该适用PP3而不是PM5。

PM3

当一个变异与一个已知的致病变异呈反式时，PM3规则可用于隐性疾病。非编码区变异，特别是影响剪接的深度内含子变异，已被发现与编码变异反式。鉴于在包括非编码区（特别是内含子区）时，可能的反式变异的搜索区域增加，我们试图确定我们期望使用GEL 100,000基因组学项目数据集的罕见疾病三联体观察一个或多个反式罕见变异的频率。

鉴于本分析中发现的反式变异数量较少，我们认为按照现有的编码区变异指南应用PM3是合适的。然而，特别重要的是要使用严格的等位基因频率分界线，以限制只考虑适当的罕见变异，并且只考虑影响基因的变异，这些变异是导致个体表型的可靠原因。

PS3

功能性证据对于支持非编码区变异的致病性或良性作用极为重要。根据变异体的背景及其预测的影响（如对剪接、转录、翻译或染色质循环的影响），通常需要进行专门的检测，应按照现有的指导原则设计和评估功能检测方法。

许多非编码区变异可能只有部分影响；例如，影响转录物子集的剪接变异，或仅部分减少下游编码序列翻译的5′UTR变异。因此，为确定PS3适用范围的基因特异性阈值，在全部影响范围内对检测进行基准测试将是非常重要的。

在考虑BS3时，如果功能检测没有显示出对基因产物或其表达的影响，应该注意检测有没有在相关组织或细胞类型中进行，因为调节和转录物的使用可能非常具有组织特异性。此外，如果一个实验只评估一个输出，但有多种可能的基本机制（如5′UTR变异），则不应该应用BS3。

调节性变异可以起到增加或减少目标基因的表达。在某些情况下，当该基因的已知机制是功能缺失时，一个经过功能测试的变异可能会引起功能增益。当这种作用方向与已知的基因机制不一致时，可以应用BS3（尽管我们注意到许多剂量敏感的基因可能既是单倍体也是三倍体敏感的）。

PP3/BP4

大多数广泛使用的预测变异有害性的计算工具旨在解释编码错义变异的影响。这些工具不能应用于非编码区的变异。然而，有多种工具可以预测变异对剪接的可能影响，也有少数工具可以沿着前mRNA转录物的完整长度进行预测。最近发表了对现有剪接工具的比较，表明一些工具（如SpliceAI）在优先考虑具有异常剪接功能证据的变异方面表现良好。最近也对可用于预测其他类别的非编码区变异的缺失性的硅学工具进行了审查（见Rajano等人的表3）。除上述工具外，我们注意到最近专门为罕见病设计的工具。NCBoost、ReMM（Genomiser）和GREEN-DB。