独家解读：mtDNA变异致病性分类指南

线粒体基因组DNA（mtDNA）变异有别于核基因组变异，具有其独特性质，如母系遗传、变异异质性、阈值效应、不存在剪切、单倍群效应等。虽然MITOMAP网站会列出明确致病的变异（Cfrm Mutations），但对不在此范围的变异，临床实验室对于致病性的解读仍存在不一致，所以由多个专家组成的工作组（MSeqDR-ClinGen mtDNA expert panel working group）在2015年ACMG/AMP变异解读指南的基础上，对mtDNA变异致病性分类做了进一步规范。下面小编就将内容分享给大家。

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mtDNA和变异的特殊性

mtDNA包含37个基因（13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因），没有内含子，不会发生剪切和同源重组。目前，推荐使用NC_012920.1为其参考序列。

mtDNA上的变异遵循母系遗传，存在外显不全、可变表达和遗传异质性。此外，mtDNA变异还有阈值效应，即特定致病变异在受影响的组织中达到一定突变比例时才会表现出相关表型。对于所有mtDNA致病变异，没有一个绝对阈值，因为有些变异可能在较低水平上引起症状，而其他变异可能在较高水平上才导致疾病。在不同的组织类型中，特定mtDNA变异的突变比例也是不同的。

02

mtDNA变异致病性分类指南解读

原ACMG/AMP指南中的一些条款仍适用于mtDNA，但有一些不再适用。这些条款的综合计算结果仍会得出五种致病性分类中的一种：致病性、可能致病性、意义未明、可能良性和良性。

1.PVS1

mtDNA基因不会发生无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），但PVS1仍可用于mtDNA变异，且只适用于蛋白编码基因，不适用于起始密码子突变，也不适用于tRNA或rRNA基因的缺失或重复，具体使用过程详见上图。

2.PS1, PM5, BP7

PS1的使用与原指南一致，但只适用于蛋白编码基因，无升降级使用。

PM5的使用与原指南一致，一般情况下只适用于蛋白编码基因，但如果是在tRNA或rRNA基因的已知致病变异的同一核苷酸位置发生的不同碱基变化，可降至“Supporting”级使用。

BP7只适用于发生在蛋白编码基因上的同义突变，无升降级使用。

3.PS2, PM6

PS2的使用前提是受检者母亲必须进行检测，且是mtDNA基因组测序，不能是特定位点的一代测序。最好检测母亲的多种组织，同时注意检测方法的使用，避免漏检。可升降级使用。

PM6的使用情况是受检者母亲mtDNA基因组未被测序，只进行了变异位点的检测且未检出。可升降级使用。

4.PS3, BS3

对于功能实验类证据的要求是最好对有mtDNA变异的患者原生细胞系的生化缺陷进行研究，包括酶活性、线粒体翻译过程、呼吸链复合体组装的检测。对于变异的重组杂交细胞系研究，仍需在满足原生细胞系存在生化缺陷的前提下才可进行。PS3在使用时要求与对照组相比，实验组的生化活性降低80%以上或＞2个标准差。原生细胞系和杂交细胞系的异质性均要≥60%，实验具有重现性和一致性。无升降级使用。

5.PM2, BA1, BS1

人群携带率数据也适用于mtDNA变异。所参考的数据库要能及时维护和更新，里面的数据具有较好的测序质量，同时使用时要注意种群的分布。目前可用的数据库有MITOMAP、HmtDB、HmtVar、MSeqDR等。

携带率＜0.00002可用PM2；＞0.01可用BA1；介于0.005-0.009之间，可用BS1。

6.PM4

PM4的使用与原指南一致，但只适用于蛋白编码基因。无升降级使用。

7.PP1, PS4, BS2, BS4

使用PP1和PS4时要求mtDNA变异只存在于母系成员中，且这些个体的表型要与异质性水平相匹配，即异质性水平低的症状轻或正常，高的则症状更严重。不能使用LOD值，而是根据共分离次数来判断证据的强度。不适用于变异以同质性状态存在所有家庭成员中的情况。

8.PP3, BP4

之前适用于核DNA变异的预测工具，不再适用于mtDNA，但也有其他相应的工具。MITOMAP网站的APOGEE可预测变异对蛋白编码基因的影响，分值≥0.5可用PP3；＜0.5可用BP4。MITOMAP的MITOMASTER可得出Mito TIP score，HmtVar可得出HmtVAR disease score，综合二者结果得出相应的证据等级。

9.PP4

PP4主要侧重疾病表型，但由于mtDNA变异的特殊性，在使用时要注意以下几点：

·只能通过检测线粒体电子传递链（ETC）的活性来评估

·检测样本为肌肉、肝脏等高耗能的组织或已建立控制范围的组织

·若检测的是成纤维细胞系，则必须在多个不相关的先证者中发现和/或在不同的个体中检测

·不适用于口腔样本的ETC活性检测

· ETC活性检测结果无异常不能作为良性证据（具有致病性mtDNA变异体的个体可能具有正常的ETC酶活性，并且这些研究可能受到进行分析时个体年龄的影响）

·检测应由临床认可的实验室来进行，并且必须使用年龄和组织一致的对照组

·其他原因导致的ETC活性缺陷必须排除

10.BP2, BP5

BP2和BP5适用于患者存在其他明确病因的情况，不适用于另一明确mtDNA致病变异的异质性水平较低的情况。

11.不适用于mtDNA变异的条款

PM1、PM3、PP2、PP5、BP1 、BP3和BP6。

小结

mtDNA变异和核基因组变异致病性的评估标准大体是相同的，其中所用到的共分离数据、功能研究，以及case-control数据是判断mtDNA变异（无论是致病还是良性）致病性的关键决定因素。鉴于mtDNA变异的特殊性和评估过程的复杂性，普及其应用还是有难度的。目前mtDNA检测报告的解读主要依托于MITOMAP的Cfrm Mutations，但小编还是希望大家能尝试着使用，推进mtDNA变异解读的一致性。

参考文献

[1]McCormick EM, Lott MT, Dulik MC, et al. Specifications of the ACMG/AMP standards and guidelines for mitochondrial DNA variant interpretation. Hum Mutat. 2020;41(12):2028-2057. doi:10.1002/humu.24107

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