|
最近的技术突破，如直接电子探测器的发明和新的图像处理算法的实现，已经使冷冻电子显微镜（cryo-EM）可以以原子或近原子分辨率测定大分子结构。作为该技术的核心仪器，现代透射电子显微镜（TEM）具有相当复杂的电子光学，仍然有很大的空间可以进一步改善。材料科学界目睹了一些新的电子光学设备的应用，揭示了亚原子分辨率的结构。如果低温电磁技术可以从包括相位板和Cs校正器在内的新型光学调谐设备中获益，那么前景将是十分诱人的。 根据对比度转移理论，传统TEM（CTEM）的不对称数据收集策略已经被利用了几十年，对比度转移理论预测了弱相生物标本的正弦对比度传递函数（CTF）。在物镜的后焦平面上添加相位板可以将CTF调制为余弦函数。使用相位板的主要优点是图像对比的强劲增强。在2015年，使用带电薄膜（即所谓的伏尔塔相位板Voltaphase plate，VPP）的新型相位板被证明能够给出生物分子的高分辨率图像。结合直接电子检测器，VPP允许以近原子分辨率重建几种蛋白质结构。 理论上，显微镜中没有信息丢失，而完美的物镜没有球面像差。然而，物镜中的球面像差的下降导致图像中的信息失真，特别是在高频下这个问题尤为突出。这样的问题可以通过使用物镜的Cs校正器来克服。与CTEM得到的结果相比，配备有Cs-校正装置的显微镜也已经显示能够解决核糖体的结构分辨率高于3Å。尽管理论分析和模拟表明组合将在高空间频率下维持更多的结构信息，但尚未报道使用相位板和Cs校正器的组合来进行高分辨率冷冻电镜的尝试。 近日，清华大学生命科学学院王宏伟教授领导的研究组在Structure上发表关于冷冻电镜新成像技术的论文。该论文首次提出并使用过焦成像技术获得高分辨蛋白结构，同时也为Cs校正技术和相位板技术在冷冻电镜生物研究领域的应用提供了新思路。
研究团队首先进行了理论分析，并指出相位板和Cs校正器的组合可以产生适用于低聚焦和过度聚焦成像条件下的高分辨率结构的图像。给带有Cs校正器的电子显微镜配备VPP，在低聚焦或过度聚焦的成像条件下对冷冻的apo-ferritin进行成像，得到约3Å的分辨率。VPP和Cs校正器的组合显示出了用于高分辨率cryo-EM的新颖成像能力。 使用相位板和Cs校正器的低聚焦和过度聚焦低温电磁场的CTF 对于TEM中的薄生物样本，弱相位预测将TEM图像的傅里叶变换作为TEM对象投影的傅里叶变换与TEM电子光学系统的CTF的乘积。 CTF的简化形式可以写成： 通过在TEM中配备Cs校正器，大大降低Cs值，可以具有非常小的Cs值（ 0.001mm），等式中的正弦函数的第二项可以被忽略。 因此，方程式变为： Cs校正器和相位板的组合允许使用低聚焦或过度聚焦的成像条件在生物学领域的使用冷冻电镜。
通过VPP-Cs-校正器联用的Cryo-EM对apo-ferritin进行单粒子重建 为了测试上述理论，研究团队建立了一个程序（STAR方法），使用VPP-Cs-校正器联用的cryo-EM来收集冷冻的apo-ferritin的低温EM图像。他们故意收集样本的低聚焦和过度聚焦的数据集，相移范围为0.2π至0.8π。因此产生了三个数据集，并将所有三个数据集视为未被聚焦的图像，用于CTF参数确定，并使用所有图像，无论其内部的相移量如何，采用标准的Relion图像处理策略进行单粒子分析。对于所有三个数据集，他们成功地进行了三维分类和修复，并获得了在2.9Å、3.2Å和3.0Å。三次重建似乎几乎完全相同。微妙的分辨率差异似乎与数据集质量有关。
VPP数据集重建的剂量依赖性
Cryo-EM已经将结构生物学引入了一个新的时代，其中大分子结构的原子或近原子分辨率更容易被获得。研究表明，相位板或Cs校正冷冻EM的应用可以解决高分辨率结构的问题。到目前为止，还没有报告使用相位板和Cs校正器的组合获得高分辨率结构图形，或者由过度聚焦成像条件收集数据得到结构确认。VPP-Cs校正器联用冷冻EM在过焦点成像条件下成功获得apo-ferritin的原子分辨率图像不仅证明了这种组合光学系统的可行性，而且还发现了系统的一些有趣的优点值得进一步调查研究。除了数据采集性能，Cs-校正器和VPP的组合还显示出比单独使用时更好的光学性能。在未来的显微镜中，当下一代Cs校正器变得更加稳定并且能够自动校正，相位板变得更加坚固，相位板和Cs校正器的组合可能成为高效的工具。
了解更多最全、最新论文快讯 登录CBG官网（www.chembeango.com） 下载ChemBeanGo APP CBG资讯 ∣知识就是力量 |
|
|
