 空气污染（包括PM2.5）袭击了世界上大多数国家，造成了严重的环境问题，大大增加了全世界的健康风险，已严重影响超过8亿患有呼吸系统疾病的人。作为中性粒细胞嗜天青颗粒的主要成分，人类中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）参与病原体的破坏和呼吸道的炎症过程调节，还可以切割气管的细胞外基质成分，并促进中性粒细胞向炎症部位迁移，而炎症部位与常见的肺部疾病高度相关。因此，HNE被认为是药物发现的治疗靶标，也是多种肺部疾病的生物标志物。鉴于其光化学和光物理特性以及可调节的发射范围，基于量子点的荧光策略可以改善传感性能，此类成像探针已被用于酶测定。荧光共振能量转移（FRET）通常发生在两个距离适当的荧光团之间（<10 nm），但是用于监测体内蛋白酶活性仍然存在FRET的变化并不明显、荧光传感特性不足等缺陷。将有机染料与量子点整合到肽底物中可以提供一种可控且可扩展的策略用于构建检测蛋白酶的FRET系统。 基于FRET系统的纳米探针检测HNE活性机制示意图 （来源：ACS Nano） 近期，华中师范大学杨光富教授和杨文超教授合作报道了通过将磺基罗丹明B和羧基化的量子点组装到寡肽底物（QPMAVVQSVPQK）中，构建了基于FRET系统的纳米探针，用于肺部疾病成像。该底物在两个缬氨酸残基之间的酰胺键可被小鼠和人类的弹性蛋白酶水解，用于检测体外和体内的HNE。通过该纳米探针可以将活细胞和肺癌小鼠模型中内源性HNE进行高度灵敏和特异性的监测，并且成功地用于检测患者血清中的HNE活性。相关成果以“Human Neutrophil Elastase Activated Fluorescent Probe for Pulmonary Diseases Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer Using CdSe/ZnS Quantum Dots”为题发表在ACS Nano上（DOI: 10.1021/acsnano.9b09493）。
基于FRET的肽探针通常可用于监测体内蛋白酶活性以对体内的特定靶分子进行成像。一般来说，FRET的肽探针包括三个部分：量子点作为供体，磺基罗丹明B（Rh）作为受体，HNE特异性肽作为连接体。在量子点表面上的羧基活化后，作者将两种弹性蛋白酶特异性肽QPMAVVQSVPQK-Rh（P1）和APEEIMAQK-Rh（P2）通过酰胺键整合到量子点表面，从而制备量子点-肽复合物。通过比较P1和P2对量子点的淬灭效率和HNE的裂解效率，作者选择了P1来构建基于量子点的FRET探针。CdSe/ZnS量子点和InP/ZnS量子点分别与P1组装，InP/ZnS快速被磺基罗丹明B淬灭，而 CdSe/ZnS探针具有更高的FRET效率和HNE催化活性。HNE可以裂解FRET探针中两个缬氨酸之间酰胺键连接处，导致FRET系统破坏，量子点的绿色荧光恢复和Rh的红色荧光下降。 为了验证FRET探针组装过程，作者分别进行了动态光散射、透射电镜、Zeta电位和红外光谱测试。作者通过光致发光光谱研究了该探针的FRET效率和是否存在交替激发缺陷，发现FRET效率高达78.5%，并且该探针可以克服来自动物组织的干扰并用于体内成像。该FRET探针特异性和灵敏性分别采用不同的蛋白酶和不同浓度的HNE在复杂的生物样品中研究该FRET探针的特异性和灵敏性，发现该探针具有高度的特异性和低至7.15 pM的检测限。在生理条件下，作者通过Michaelis-Menten曲线研究了该探针作为底物的动力学特征和HNE活性及其抑制剂的能力。根据该米氏方程曲线得到的动力学参数（Km和Km/kcat）分别为~142.3 nM和~997 mM-1·s-1。该探针的总体催化效率（Km/kcat）与商业底物几乎相同，但对该探针的亲和力比商业底物高275倍（Km）。 HNE对FRET探针和商用底物的Michaelis-Menten曲线和抑制药物浓度曲线 （来源：ACS Nano） 由于HNE促进肺肿瘤的生长，于是作者将FRET探针应用于肺癌细胞（A549）中的HNE成像。通过FRET探针在A549细胞中的定位，作者发现量子点和染料标记的肽特异性地在溶酶体中积累，这可能是A549细胞的吞噬作用和静电相互作用引起的。接下来，作者将FRET探针直接注入小鼠肺癌模型以研究其体内成像能力。在原发性肿瘤位置，绿色荧光逐渐增加，而红色荧光随时间延长而减弱。FRET探针的体内研究还揭示了肺部肿瘤进展与HNE水平升高之间的强烈关联。为了探究绿色荧光增强是否由于活细胞中HNE的动态变化引起的，作者通过蛋白质印迹分析证实了脂多糖刺激确实增加了细胞中的HNE浓度。FRET探针可以监测炎症诱导的活细胞中HNE的增加，于是作者通过脂多糖诱导的急性肺损伤研究该探针在炎症环境中的表现。通过直接检测3名健康人和13名患有不同肺部疾病（肺癌、肺结核和肺真菌病）的人血清样品中的HNE发现，患有不同肺部疾病的患者的HNE水平均显着高于健康人。通过基于FRET探针的方法检测到的HNE水平与临床诊断高度相关，该方法适用于定量测定临床样品中的HNE。
HNE对FRET探针和商用底物的Michaelis-Menten曲线和抑制药物浓度曲线 （来源：ACS Nano） 小结：华中师范大学杨光富教授和杨文超教授合作报道了通过将磺基罗丹明B和羧基官能化的量子点组装到寡肽底物（QPMAVVQSVPQK）中，构建了基于FRET系统的纳米探针用于肺部疾病成像。该研究为基于量子点的FRET系统分析酶活性提供了有价值的策略，明显提高了催化效率、灵敏度和光稳定性。由于HNE是重要的治疗靶标，该探针还可用于高通量筛选HNE抑制剂以发现药物。该策略证明了基于FRET系统的纳米探针在成像性能方面的优势，并为体内HNE检测和肺部疾病诊断提供了新的工具。 |
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