【原】每篇文章都是一出感情戏~最后一张图亮了

作者：Lucky King（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

长链非编码RNA00152通过与EZH2相互作用抑制IL24，促进肺腺癌增殖。（回复“170428”下载文献，一周有效）

只有不到3％的人类基因组编码蛋白质，而至少75％的基因组转录为非编码RNA，包括microRNA（<200nt）和长链非编码RNA（> 200nt）。

许多研究已经表明，miRNA可通过结合3'非翻译区，抑制转录调控靶基因的表达，来调控生物作用。本期文章主角继续是长链非编码RNA(lncRNA)—LINC00152。

使用生物信息学工具 “lncRNAtor” （http://lncrnator./expression.htm） 分析肺腺癌（LAD）组织中的lncRNA表达（n = 291），LINC00152在LAD肿瘤组织中高度表达，比正常组织高出约2.63倍（Fig.1a）。

使用癌症基因组Atlas数据库，LAD组织中LINC00152表达量显著上调（Fig.1b）。

qRT-PCR检测60例样本，与相邻正常组织相比，LAD肿瘤样本中LINC00152的表达量增加（Fig.1c）。

qRT-PCR检测16HBE细胞和LAD细胞系中的表达水平：A549和SPCA1细胞LINC00152表达水平高，H1299表达水平最低（Fig.1d）。

（Fig.1e & f）Kaplan-Meier生存分析，用于检查LINC00152与LAD患者的预后关系，高表达患者无进展生存时间和总生存时间明显更短。

这些结果表明LINC00152在LAD发生和进展中具有重要的生物学作用。

表1. LINC00152表达与患者临床病理特征相关性。

 

LINC00152沉默抑制LAD细胞增殖

使用siRNA沉默LINC00152表达，转染48h后，与对照相比，A549和SPCA1细胞增殖能力显著降低（Figure S1a）；

将pcDNA3.1-LINC00152载体转染H1299细胞，LINC00152表达显著上调（Figure S1b）。

(Fig.2 a) siRNA转染A549和SPCA1细胞，细胞活力显著降低。增加H1299细胞中LINC00152的表达水平，细胞活力显著增加（Fig.2 b）。

Colony Formation Assay集落形成实验，沉默LINC00152后，A549和SPCA1细胞的集落形成能力显著减少(Fig.2 c)；H1299细胞LINC00152过表达后，集落形成能力显著增加(Fig.2 d)。EdU(红色)/DAPI(蓝色)免疫染色测定得到一致结果(Fig.2 e & f)。

表明LINC00152促进LAD细胞增殖。

 

流式检测细胞周期

用si-RNA转染A549和SPCA1细胞，流式细胞仪分析显示：细胞周期停滞在G1/G0期数量显著升高（Fig.3 a & b）。

LINC00152经siRNA沉默后可增加LAD细胞凋亡（Fig.3 c & d）。

WB检测凋亡抑制基因Bcl-xL，siRNA转染的细胞中Bcl-xL蛋白水平显著降低（Fig.S1c）。

 

LINC00152促进体内LAD肿瘤细胞发生

构建异种移植小鼠模型，以验证LINC00152在LAD肿瘤发生中的致癌作用。将转染sh-LINC00152和空载体的A549细胞注射到裸鼠中，18天后观察发现LINC00152沉默显著降低了肿瘤生长，sh-LINC00152组小鼠中形成的肿瘤小于对照组（Fig.4 a & b）。sh-LINC00152组肿瘤重量小于对照组（Fig.4c）。

将稳定转染pcDNA-LINC00152、空载的H1299细胞注射到裸鼠中，18天后观察发现LINC00152过表达可以促进肿瘤生长（Fig.S2 a & b）。

qRT-PCR分析显示，sh-LINC00152组LINC00152表达量低于空载组（Fig.4d）。免疫组化显示，LINC00152沉默组Ki-67染色降低，反映较低的增殖指数（Fig.4e）。

表明，LINC00152在体内参与了LAD的致癌活化。

说完LINC00152和表型的关系，接下来就该往通路上靠了~

（Fig.5a）A549和SPCA1，细胞核中LINC00152的表达量高于细胞质，作者认为LINC00152是转录水平的调节因子。

为了证明这个猜想，进行了RNA免疫沉淀（Fig.5b）：LINC00152与A549 & SPCA1细胞中的EZH2和LSD1直接结合；RNA pulldown实验得出同样结论（Fig.5c）：LINC00152与LAD细胞中的EZH2 / LSD1直接相互作用。

生物信息学分析：LINC00152敲除后，SPCA1中有基因上调，基因下调（表2）；在这些基因中，挑选出和肿瘤相关的，上调倍数变化较大的IL24，再加WB印证一下（Fig.5 d & e）

使用染色质免疫沉淀（教你撩5分傻白甜~）来确定IL24和EZH2、LSD1间的关联。显示EZH2与IL24启动子位点结合（Fig.5h），然而，LSD1未结合IL24启动子位点（文献补充图）。

敲除LINC00152后，降低了IL24启动子基因座中H3K27me3的占有率（H3K27的甲基化在lncRNA表达调控中具有调控作用，即指标）（Fig.5h）。

这些结果表明LINC00152通过与EZH2的相互作用，部分抑制IL24的表达。

 

IL24与LAD细胞增殖关系

转染pcDNA3.1-IL24载体后，A549和SPCA1细胞中IL24表达量增加（Fig.6a S1f）。

MTT和集落形成实验显示，IL24过表达降低LAD细胞增殖能力（Fig.6 b&c）；

流式细胞术分析：IL24增加G1/G0期阻滞，诱导细胞凋亡（Fig.6 d&e）；

IL24表达与LINC00152表达显著负相关（Fig.6f）；

免疫组化显示，LINC00152稳定敲除的A549形成肿瘤中IL24染色较高（Fig.6g）；

结果表明IL24的表达抑制细胞增殖，并诱导LAD细胞凋亡。

验证IL24是否参与LINC00152介导的LAD细胞增殖：

将pcDNA3.1-LINC00152和pcDNA3.1-IL24共转染A549、SPCA1细胞，MTT结果表明，IL24过表达部分降低了LINC00152过表达促进的LAD肿瘤细胞增殖作用（Fig.7 a-c）；

Western印迹显示，LINC00152+IL24共转染细胞中IL24表达水平降低（Fig.7d）。

结论，LINC00152通过下调IL24促进LAD细胞的增殖。

这篇文章和上期的文献可谓姊妹篇，简单事情多重复自然就会明白其中的套路。这篇不过换了男主角（LncRNA）和女主角（通路分子）。

同样是5.888分的文章，这篇文章实验比较多，涉及面较好较完整：有临床数据、生信分析（干实验），细胞分子实验&动物实验（湿实验）。