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作者：米粒儿 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 解螺旋2017文献精读秋季班于上周正式启航，第一讲蘑谷老师和大家一起分享转录组学研究套路。选取文献来自gastroenterology，该杂志是胃肠病领域权威性的期刊，影响因子15分左右，重视基础性研究。 从文章题目看出本文主要关注两个内容： 第一：DRD2在人胰腺导管腺癌中高表达； 第二：DRD2抑制剂延缓小鼠肿瘤生长。 题目简明扼要的点出DRD2可能参与人胰腺导管腺癌发生和发展，抗DRD2治疗可能成为潜在的治疗靶点。 背景知识 在Golobocan 2012对各种肿瘤发病率和死亡率的统计数据显示，胰腺肿瘤虽然发病率不及乳腺癌，肝癌等，但是其发病率和死亡率非常接近，这是近年来胰腺肿瘤受到重视的原因。而在胰腺相关的肿瘤中，胰腺导管腺癌（PDAC）占了90%以上。 对于PDAC患者来讲，手术是最佳治疗方式，但是临床上仅有20%的患者有接受手术机会。除了手术之外，以吉西他滨为主的胰腺化疗是主要的治疗手段，但是吉西他滨治疗六个月后，大部分患者都会产生明显的耐药性，因此临床上急需探索PDAC新型靶点和治疗药物。 本文作者以该问题为切入点，采用转录组学方法寻找新的治疗靶点。文章主要思路如下图所示： 首先采用基因芯片方法筛选差异表达基因，结合KEGG数据库分析发现GNAI可能参与PDAC发病过程，然后分析了GPCR和cAMP通路，发现了DRD2也参与PDAC发病过程，并进一步研究DRD2在PDAC中的表型，包括细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡，细胞迁徙和肿瘤转移。 结果总览和数据解析 本文共6张图，大致分为3个部分 Fig.1 通过芯片筛选发现GNAI2互作的DRD2在 PDAC组织中高表达 Fig.2-5 敲减或者药物阻断DRD2抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡和G1阻滞，抑制肿瘤迁徙 Fig.6 药物治疗作用，阻断DRD2抑制小鼠体内肿瘤转移 Fig.1 GNAI2互作蛋白DRD2在 PDAC组织中高表达 首先采用基因芯片筛选，发现1676个基因表达上调，1166个基因表达下调。通过KEGG在线数据库中确定异常表达分子集中在Pathway in cancer（Fig 1A）。 接下来，对pathways in cancer通路中分子按照参与通路的数量排序，并进行文献检索，发现未见报道排在第一位的是GNAI2，所以作者首先锁定了这一分子（Fig1B）。 紧接着采用生物信息学方法进一步分析GNAI作用靶点，通过HPRD数据库检索发现GNAI与很多分子都有共表达，尤其是GPCR和cAMP通路。 进一步的通过consensus pathDB数据库分析，发现DRD2是最重要异常节点，与它相邻的一级和二级节点都是高表达的。从而最终确定了本文关注的主要分子DRD2（Fig 1C）。 数据库分析的数据需要进一步的实验验证，作者收集PDAC组织63例，慢性胰腺炎组织49例标本，免疫组化结果显示DRD2蛋白在PDAC组织中显著高表达（Fig 1D）。 Fig. 2：敲减DRD2抑制肿瘤生长 在确认了DRD2在PDAC组织高表达之后，下一步作者主要关注DRD2细胞表型。在肿瘤细胞中构建2个shRNA敲减DRD2后，采用克隆形成实验检测细胞增殖情况。发现敲减DRD2抑制细胞增殖（Fig 2A）。 同时，构建免疫缺陷小鼠接种DRD2缺陷的Panc-1后，发现DRD2缺陷鼠成瘤更小（Fig 2B） 免疫组化结果也显示DRD2缺陷鼠的DRD2和Ki67表达量显著降低。
图2通过细胞和动物实验发现DRD2在肿瘤增殖和生长中起到重要作用。 Fig.3 药物阻断DRD2抑制细胞生长 药物阻断DRD2后，对细胞生长有什么影响呢？这是图3主要回答的问题。这一部分实验作者共用到6个细胞系，如下表所示。包括正常人体细胞，原位细胞和肝转移细胞。同时用到FDA批准的DRD2抑制剂Pimozide。
图A中作者检测了药物作用下，细胞活性的改变，发现药物抑制肿瘤细胞生长呈剂量依赖性。并且药物对Mia和BxPC-3抑制作用更强，为了解释该现象作者采用western blot实验检测各细胞系中DRD2表达量，发现Mia和BxPC-3细胞中DRD2表达量更高。克隆形成实验也显示药物和细胞生成呈现剂量依赖性。
下边作者引入另外一个表型-内质网应激。药物阻断后，分别检测了内质网应激的标志物改变。药物阻断DRD2后p-PERK表达升高（图B），阻断DRD2使得胞浆Ca2+浓度升高 （图C），阻断DRD2使得胞浆P-PAK表达升高 （图D），cAMP/PKA通路参与阻断DRD2诱导的内质网应激 （图E），以上数据说明DRD2缺陷诱导内质网应激。
Fig.4阻断DRD2诱导细胞凋亡和G1阻滞 相关文献报道内质网应激可引起细胞周期阻滞，于是作者在图4中检测阻断DRD2后细胞周期分布情况。发现阻断DRD2后发生G1期阻滞，sub-G1期升高提示细胞凋亡增加 (图A)。 Caspase活性随药物浓度增加而升高，说明DRD2抑制可以诱导细胞凋亡 (图A)。和细胞周期调节相关蛋白P27、P21表达升高，Cyclin E、D1、P-Rb表达降低，证实了G1期阻滞 (图B)
凋亡的分子机制中引入了未折叠蛋白（UPR）这一表型，这是因为有文献报道perk激活可导致UPR诱导的凋亡，其中eIF2a，ATF4，CHOP都参与这一过程。 在阻断DRD2后，P-eIF2a, ATF4和 CHOP表达升高 （图C）；shDRD2 Panc-1细胞转染小鼠，P-eIF2a, 和CHOP表达升高（图D）；敲减ATF4（Fig.S3），细胞活性增强（图E）；敲减ATF4，细胞凋亡减弱（图F）。以上实验结果证明未折叠蛋白参与DRD2缺陷诱导的生长抑制。
Fig.5 阻断DRD2抑制肿瘤迁徙 图5中作者引入肿瘤迁徙这一表型，检测阻断DRD2后，肿瘤迁徙情况变化。划痕试验说明药物能够抑制细胞的迁徙（图A）；相应的细胞迁徙特异性marker表达也发生变化 Cadherin表达升高，Vimentin表达降低（图B）； 3D培养，药物浓度增加，迁移细胞数量显著减少 (图C)；加入cAMP 抑制剂（SQ22536）和PKA 抑制剂（H89）后，迁移细胞数量显著增加 (图D)。以上实验结果说明阻断DRD2通过cAMP/PKA通路抑制肿瘤细胞迁徙。
Fig.6 阻断DRD2抑制肿瘤转移 图6作者研究另外一种FDA批准的DRD2抑制剂haloperidol对肿瘤细胞表型影响。其中药物抑制肿瘤细胞活性呈剂量依赖性（图A）；药物促进凋亡增加 (图B)；敲减ATF4，细胞活性升高 (图C)，凋亡降低 (图D)。 加入cAMP抑制剂（SQ22536）和PKA 抑制剂（H89）后细胞迁徙增加 (图E)。以上实验结果与Haloperidol药效一致。
最后作者进行了动物实验，证实药物阻断DRD2后，肿瘤重量和体积显著降低，药物组转移灶明显减少，说明阻断DRD2减缓小鼠体内肿瘤的生长和转移。
套路解析 在套路解析中，蘑谷老师为大家仔细总结了本文五恒量和三变量的研究体系，即疾型模法标和分子药物和通路。 最后和大家讨论了本文存在的几个小问题。第一：在PDAC 芯片中DRD2 mRNA 倍数变化=1.08 (P < .0002)小于2，因此最初并未将其作为目标分子，这可能是因为DRD2的作用呈现“瓶颈效应”而且 DRD2 蛋白的表达上调可能与转录后修饰有关。 第二：在血液病和胶质瘤中，STAT-5和ERK通路参与调节DRD2但是PDAC中未发现以上通路激活，这是肿瘤通路异质性引起的。第三相关文献指出接受DRD2抑制剂治疗的精神分裂症患者甚少罹患肿瘤，而本文也证实DRD2抑制剂可能成为PDAC治疗靶点，因此需要对该药物重新定位。 |
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