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作者：桃夭夭 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 今天跟大家分享的是2017年9月11日发表在Nature immunology上的一篇名为“De novo induction of intratumoral lymphoid structures and vessel normalization enhances immunotherapy in resistant tumors”（回复171010可下载，一周有效）的文章。 文章结合了肿瘤血管、肿瘤微环境和肿瘤免疫治疗等一系列的肿瘤领域热点问题，在肿瘤研究和治疗方面又向前迈进了一步。 科学假说 肿瘤免疫治疗和预后与肿瘤内效应T细胞浸润有密切联系。在终末期肿瘤中，往往存在异质性肿瘤微环境，其通过重塑和诱导血管生成，改变血管内皮黏附分子(如ICAM和VCAM等),来阻碍T细胞进入肿瘤内。T细胞的活化和浸润受次级淋巴器官(SLOs)的调节，刺激淋巴器官有其特定的结构，比如表达L-选择素（依赖LTβR）、CCL21的高内皮静脉（HEVs）等。 而在肿瘤、炎症、自身免疫疾病及感染等疾病条件下，人体会生成一种类似于LSOs的淋巴结构，也称为三级淋巴结构（TLSs）。理论上，TLSs应该也具备募集和活化T细胞的功能，从而具备抗肿瘤作用。 但前期研究发现TLSs与肿瘤进展和耐药相关。肿瘤基质中的LIGHT能通过与LTβR及HEVM结合，募集和激活T细胞、诱导产生和维持SLOs，也能在肿瘤条件下诱导TLSs产生。因此，研究者假定LIGHT能够促进血管正常化，在此基础上诱导具备汇集T细胞的、具有抗肿瘤能力的TLSs产生。 结果分析 1、 瘤内LIGHT效应具有剂量依赖性 2、 LIGHT-VTP诱导固体肿瘤内淋巴组织再生(TLSs) 3、 巨噬细胞和T细胞对TLSs的形成具有重要作用 4、 LIGHT-VTP单药治疗诱导产生保护性抗肿瘤免疫 5、 LIGHT-VTP提高免疫检查点抑制剂疗效 6、 LIGHT-VTP联合免疫抑制剂治疗促进效应和记忆T细胞产生 7、 多重联合治疗固体肿瘤 首先，研究者通过利用与肿瘤血管有特殊亲和力的多肽(VTP)与鼠LIGHT结合，从而促进LIGHT进入肿瘤内，研究者通过给胰腺神经内分泌肿瘤（RIP1-Tag5）小鼠注射0.2ng、20ng、200ng、2000ng的LIGHT-VTP，每周注射两次，维持两周。 通过组织学分析肿瘤血管（CD31+）、血管表面VE-钙黏素蛋白和mRNA含量以及VE-钙黏素在细胞表面的分布，发现0.2ng-20ng的LIGHT-VTP能够使血管正常化并且活化，而2000ng的LIGHT-VTP会诱导血管坏死。 了解到LIGHT-VTP能诱导血管活化和正常化以后，研究者进一步探究了LIGHT-VTP与淋巴组织在肿瘤内生长的关系。通过每周2次20ng LIGHT-VTP治疗2周后，发现肿瘤内生长出类似于SLOs的TLSs淋巴细胞集落。组织学分析发现肿瘤内的淋巴组织有明确的T区和B区，并且MECA79阳性，意味着有HEVs形成。 新形成TLSs不具备TLSs中的初始免疫细胞，如CD11c+的树突状细胞，Gr1+的炎症单核细胞，F4/80+的单核-巨噬细胞、CD68+的肿瘤内巨噬细胞等。而TLSs中完善的细胞外间质支架结构在新生的淋巴组织中同样存在，包括网状纤维(ER-TR7),基质（IV型胶原纤维）。 通过LIGHT-VTP治疗的小鼠体内新形成的TLSs数目、单个肿瘤内TLSs数目以及TLSs覆盖的肿瘤面积均较对照组明显升高。因此，研究者认为LIGHT-VTP能够诱导TLSs形成。 那么，具体哪些因素会促进TLSs形成呢？已有研究报道，TLSs形成主要与 细胞因子和趋化因子相关。研究者进一步通过qPCR检测了新生TLSs内的细胞因子(如IFN-γ、IL-1β、IL-6等)和趋化因子（CXCL13、CCL19、CCL21、TNF和LTβ），发现经过LIGHT-VTP治疗的 CCL21、IL-1β、IL-6基因表达较对照组明显上调。 其中CCL21在SLOs形成中发挥募集和保持T细胞的作用，实验结果说明CCL21在TLOs的形成中也有关键性作用。此外CCL21与HEVs（MECA79+）、内皮细胞（CD31+）以及巨噬细胞（CD68+）也有密切相关性，而巨噬细胞（CD68+）在已知能够介导肿瘤血管正常化。IL-1β表达的上调主要与HVEM受体有关，因为阻断HVEM后， IL-1β的mRNA会减低，而阻断LTβR不会减低。 研究者分别给去除巨噬细胞的小鼠腹腔注射LIGHT-VTP和经LIGHT-VTP活化的巨噬细胞，发现注射LIGHT-VTP组IL-1β、IL-6、TNF和LTα表达并没有上升，而注射LIGHT-VTP激活的巨噬细胞组有60-80%肿瘤内有高内皮静脉形成， TLSs内T、B细胞的分布与TLSs很相似。 但是如果在输注LIGHT-VTP激活的巨噬细胞前用CD4和CD8抗体去除T细胞，则高内皮静脉形成减少，T、B淋巴细聚集数目也减少。说明经过LIGHT-VTP激活的巨噬细胞，在T细胞存在的条件下能够刺激HEVs和TLSs形成。 既然已经证实LIGHT-VTP能够诱导TLSs形成，并且明确了其中的机制，那么，LIGHT-VTP对于肿瘤治疗具体有什么疗效呢？研究者于是用LIGHT-VTP单药治疗负瘤小鼠，2周后发现实验组CD45+造血干细胞是实验组的3倍，其中包括CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞，CD11b+单核细胞DX5+自然杀伤细胞以及CD11c+树突状细胞。 同时发现，治疗组肿瘤内细胞凋亡是对照组3倍，而肿瘤细胞（tag+）是对照组的一半。继续延长治疗时间至7周，发现治疗组体重轻微下降，但是存活的时间比对照组长4周。但是去除CD8+T细胞或者但用VTP治疗则没有明显得延长。说明CD8+T细胞在LIGHT-VTP的治疗中发挥了重要作用。 同样，治疗组小鼠血糖（评估肿瘤生长的指标）下降也有所延迟，说明治疗组肿瘤生长速度有所减慢。在治疗组小鼠中也有新的TLSs（有MECA79+HEVs及围绕HEVs的T细胞结构）形成，说明LIGHT-VTP单药治疗能够促进天然免疫和适应性免疫细胞进入肿瘤内产生保护性反应。 既然LIGHT-VTP能够促进肿瘤免疫，那么与其他免疫治疗之间有没有协同作用呢?研究者发现LIGHT-VTP治疗的小鼠肿瘤内T细胞表面CTLA-4和PD-1表达均有升高，意味着T细胞功能受损更严重。 所以研究者通过将LIGHT-VTP与CTLA-4和PD-1抗体组成三联治疗，2周后发现小鼠生存时间延长了36周（单药30周），血糖下降延迟了8周（单药5周），肿瘤颜色也从红色转为白色（血管正常化）。组织学分析显示肿瘤细胞、MECA79+高内皮静脉和CD3+T细胞均消失了。 此外，对CTLA-4和PD-1抗体无反应的Lewis肺肉瘤(LLC)在LIGHT-VTP治疗下也可出现新的TLSs结构。而三联治疗时，能够明显抑制和肿瘤生长、出血并延长生存期。因此，说明LIGHT-VTP确实能够提高棉衣检查点阻断剂抗体对于耐药肿瘤的疗效。 三联治疗不仅能够提高抗肿瘤治疗疗效，而且能够促进效应和记忆T细胞的产生。研究发现，三联治疗的小鼠肿瘤内的CD4+和CD8+T细胞分别是对照组的2倍和4倍，并且这些T细胞的增殖和颗粒酶B（GrzB+）效应细胞也是对照组的2-4倍，而Treg（CD4+CD25+FoxP3+）细胞没有明显的升高。 T细胞中CD44+CCR7-的记忆细胞也明显增多而初始T细胞比例下降。这意味着三联治疗诱导产生的TLSs具有更持久有效的抗肿瘤作用。 除此外，过继性T细胞免疫治疗也是目前肿瘤免疫治疗的研究热点。那么LIGHT-VTP联合抗肿瘤（靶点Tag）的过继性T细胞免疫治疗会有什么结果呢？ 研究者利用LIGHT-VTP联合经转基因特异性表达靶向Tag的特异性抗体的CD4+T和CD8+T细胞治疗负瘤小鼠，发现小鼠生存期延长到41周，并且血糖下降延迟。说明联合治疗能够明显提高肿瘤疗效。 另外，肿瘤疫苗在肿瘤治疗中也有重要意义，与LIGHT-VTP联合治疗，其疗效也有明显提高。将LIIGHT-VTP与几种免疫治疗联合治疗肿瘤，效果明显提高。 套路分析 肿瘤血管、肿瘤免疫、免疫治疗都是目前肿瘤研究的热点和难点。本文将免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗、过继性T细胞免疫治疗等肿瘤免疫治疗方法与肿瘤微环境的研究相结合，是实体瘤免疫治疗基础向临床转化过程中的重要一环。 实验主要在小鼠体内完成，通过免疫组化、免疫荧光、流式分析、RNA分析等手段分析肿瘤微环境内的调节机制，并探索肿瘤的治疗策略。 |
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