【原】文献精读秋季班第八讲内容提要：淋巴免疫研究套路

作者：米粒儿

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上周更新的文献精读秋季班第八讲由芹菜老师主讲淋巴免疫研究套路。选取文献来自于免疫学领域专业期刊Immunity（IF2016=22.844）。是一篇与今年诺贝尔生理或医学奖获奖研究领域相关的文章。

该篇文章证实淋巴结内的淋巴细胞数量呈现节律波动，昼间淋巴结中淋巴细胞数量较少，夜间淋巴数量会增多。文章亮点：一、淋巴结及淋巴液内的淋巴细胞数量随着昼夜节律波动；二、Ccr7和S1pr1的昼夜节律性表达是昼夜机制的两个驱动因子，这两个因子所代表的分子通路在这个机制中起决定性作用；三、获得性免疫反应受到昼夜节律的影响；四、淋巴细胞生物节律的缺失会损害这种获得性免疫反应。

结果总览

正文中共展示了6张图片。主要结论如下：

Fig.1 淋巴结内细胞数量存在昼夜规律波动

Fig.2 淋巴细胞在淋巴结的定植存在昼夜节律

Fig.3 生物节律相关基因的表达调控淋巴结内细胞转运

Fig.4 淋巴细胞由淋巴结流出呈昼夜节律

Fig.5 淋巴细胞流出的节律性依赖于S1pr1的节律性表达

Fig.6 T细胞生物节律机制调控获得性免疫反应

其中图1确认生物节律现象在淋巴结细胞中存在，图2，4，5进一步的证实淋巴细胞流入和流出都和昼夜节律相关。图3展示的是昼夜节律相关的上游因子的基因表达。属于筛选范畴。

数据解构

下边进入数据结构环节，进一步理解文章的实验设计和主要内容。

图1的a，b，c三图首先确认淋巴细胞在淋巴结内存在昼夜节律现象。图a中观测到淋巴结和外周血内淋巴细胞都存在昼夜节律现象。在B中作者对实验中昼夜光强颠倒，发现淋巴细胞数量也随着光强颠倒而颠倒。但是当光强全部调节为夜间模式的条件下，淋巴细胞数目的节律性改变依然存在，这说明光强不是唯一控制昼夜节律的因素。

图c对淋巴结进行了细分，腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结等发现不同部位淋巴结中淋巴细胞都存在昼夜节律的数量摆动。

图E和图F通过阻断淋巴结的流入和流出，检测淋巴数量变化，以确认淋巴结的流入和流出是否影响淋巴结内淋巴细胞数量。

流出的阻断采用的是Fingolimod，流入的阻断剂采用α4 integrin antibody。发现流出阻断后，淋巴细胞数目增加；流入阻断后，淋巴细胞数目降低。淋巴细胞亚群CD4+,CD8+和B细胞也呈现相同的变化趋势。由此可知淋巴结的流入和流出影响淋巴结内淋巴细胞数量。

接下来作者主要关注的问题是淋巴细胞转运机制与淋巴细胞以及淋巴结微环境的关系。为了阐明这一问题，作者做了如下的实验设计，将处于不同状态的淋巴细胞（昼淋巴细胞或者夜淋巴细胞）移植到处于不同身体状态的小鼠体内（昼身体/夜身体），观察定植到淋巴结内的细胞数量。发现昼淋巴细胞在昼身体中，淋巴结中淋巴细胞最少，夜淋巴细胞在夜身体中，淋巴结中淋巴细胞最多。这说明淋巴细胞和淋巴结微环境都影响淋巴细胞转运。

接着进入通路研究阶段，首先检测了CCR7和CCL21分子昼夜变化情况，结果表明其呈现明显的昼夜节律现象。 而加入阻断剂PTX阻断CCL和CCR7表达后，昼夜节律现象消失。

 

而在图3作者主要检测了生物节律相关基因的表达。包括Bmal 1， Clock，Per 1，Per 2，Cry 1，Nr1d1，发现这些基因在本实验状态下都存在昼夜节律现象。

而Bmal 1基因消除后，昼夜节律现象消失，淋巴结内淋巴细胞数量昼夜节律变化也消失。而相关基因CCR7昼夜节律变化也消失。

图4中主要关注淋巴结中淋巴细胞流出是否呈现昼夜节律。作者在淋巴结内插管，测量不同时间点流出的淋巴液内细胞数量。结果显示淋巴液中淋巴细胞数量呈现昼夜节律现象。当定植阻断后，淋巴结内淋巴细胞数量明显下降。而在Bmal 1敲除小鼠中，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞数目昼夜节律现象不明显。细胞移植实验中，也有相同的结果。

接下来是图5，主要关注淋巴细胞流出的节律性和S1pr1表达的关系。结果表明S1pr1在淋巴结中表达呈现昼夜节律变化。而加入阻断剂后，外周血中淋巴细胞数量降低，细胞都停留在淋巴结中。这说明淋巴结内S1pr1的表达呈现昼夜节律，且S1pr1调控淋巴细胞流出。

既然Bmal1和S1pr1都影响昼夜节律现象，那么这两个基因的上下游关系如何呢？在Bmal1敲除后，S1pr1节律现象消失（图D）。图E证明Bmal1可与S1pr1启动子区域结合进而影响S1pr1表达。

而S1pr1基因敲除后，淋巴结和淋巴液中，淋巴细胞昼夜节律现象消失。以上实验结果证明转录因子Bmal1为S2pr1的上游因子，二者敲除都会导致淋巴结内淋巴细胞数量的昼夜节律消失。

前边已经将昼夜节律机制介绍清楚，下边作者主要进行临床的拓展和延伸。为了研究昼夜节律对临床免疫的影响，作者采用自身免疫病动物模型（EAE）。

图A和B显示CD69+细胞和DCs细胞都存在昼夜节律现象。图C是EAE实验结果，显示在昼间诱导EAE时，疾病严重程度更高，而在晚间诱导时，疾病发病程度下降。图D-E昼间诱导EAE时，脱髓鞘现象和炎症细胞浸润程度明显高于晚间诱导EAE。F和G是进一步证明以上现象。

而在图K和L中，在Bmal 1基因敲除小鼠中，诱导EAE后，昼夜节律现象消失。以上实验结果表明，生物节律影响获得性免疫反应。而且生物节律关键转录因子敲除小鼠的获得性免疫反应受到影响。

套路解析

套路解析中，芹菜老师总结了本文主要的实验方法。文章的实验设计主要分三部分：测量不同时间点淋巴结内细胞数量，证实昼夜节律现象存在。主要采用流式细胞技术，细胞移植技术和淋巴液导流技术。

流式细胞技术主要检测不同淋巴细胞亚型。细胞移植技术用来研究生物节律现象对淋巴细胞定植影响。淋巴液导流技术研究昼夜节律对淋巴结内淋巴细胞数量的影响。基因敲除小鼠主要是验证分子机制，即Bmal 1-S1pr1信号轴。EAE模型的应用主要是证明昼夜节律机制在临床上的应用价值。总体上看文章的实验设计完整且合理。