【原】文献精读秋季班第九讲内容提要：干细胞研究套路

作者：米粒儿

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这是一篇关于小分子化合物诱导成纤维细胞转分化为神经干细胞，及其相关分子机制解释的文章。本文通讯作者是清华大学药学院院长，第一作者是上海交通大学医学院张明亮教授。

早在2014年国内干细胞研究领域的大拿就已在世界上首次利用小分子化合物组合在一定程度诱导小鼠成纤维细胞转化为神经祖细胞。基于此，本文提出科学假设：是否能够利用小分子化合物组合高效诱导小鼠成纤维细胞转分化为神经干细胞，及其转分化的分子机制是什么？

结果总览

文章整体的研究思路是从诱导现象的建立，诱导现象验证，RNA seq大数据解析寻找到相关信号通路三大模块开展。

本文共6张图片：

• 图1是现象提出，证实M9诱导MEFs转分化为神经干细胞样细胞（ciNSLCs）；

• 图2-4是现象验证，分别证实ciNSLCs具有体外分化潜能，ciNSLCs可产生功能性神经元并具有体内分化潜能，并进行ciNSLCs的组织特异性鉴定；

• 图5基于RNA seq测序对重编程过程中大数据解析；

• 图6是分子机制解析。

数据解构

图1主要证实M9诱导MEFs转分化为ciNSLCs这一现象。

M9包含9个component。MEFs在干细胞重编程领域是最常见的起始细胞，其成分比较复杂，由于其属于胚胎系细胞，相对容易产生转分化过程。

图1A是转分化模式图，采用转基因小鼠提取出MEFs再通过化合物诱导产生ciNSLCs，该细胞还可以分化成3个胚层细胞。转基因小鼠采用 Fsp1（MEFs特异性表达）驱动Cre小鼠，并诱导下游tdTomato表达。tdTomato呈现红色，因此本文中起始细胞MEFs呈现红色。

在图1B和C，对诱导产生的神经干细胞标志物进行检测，图B采用双Markers，图C采用单Marker。证实该体系成功诱导产生ciNSLCs。

此外，作者还采用Q-PCR方法检测神经干细胞标志物mRNA表达水平。

图E是采用RNA-Seq的方法，发现MEFs诱导产生的ciNSLCs和原代分离的神经干细胞有很强的相似性，R2为0.96.

在图1作者成功建立了M9小分子化合物诱导产生ciNSLCs的这一现象。

定义一个干祖细胞，最基本的原则是根据干细胞特性，具有无限增殖和自我更新能力和多潜能分化能力。在图2作者便对ciNSLCs体外分化潜能进行鉴定。分别鉴定了神经元（图A-E），少突状胶质细胞（图F）和星形胶质细胞（图G）。方法为免疫荧光染色方法检测各个细胞的标志物。

既然ciNSLCs可诱导产生神经元细胞，那么诱导得到的神经元细胞是否具有电生理功能呢？这是图3主要关注的问题。A-F通过不同方法证实了诱导得到的神经元细胞具有电生理功能。

此外，前文体外实验中证实ciNSLCs具有分化能力，那么在体内是否具有分化能力呢？这在临床应用是非常重要的。接下来，将ciNSLCs注入小鼠瘤内，一段时间后，通过组织切片的方法检测其在体内是否分化成不同亚型的细胞，结果如图G所示。 显示MEFs和神经元，少突状胶质细胞和星形胶质细胞都有明显的共表达。

神经干祖细胞本身也分为不同的亚型，例如前脑，中脑，后脑等。在图4作者进行了更细致的研究，检测了不同代数的ciNSLC前脑和中脑标志物（A和B）。在2代时，前脑标志物为阴性，而中脑标志物为阴性。在12代时刚好相反。图C是Q-PCR实验，对更多标志物进行检测。D图对背侧分化倾向进行检测。

E和F中显示ciNSLC主要分化为背侧运动神经元。

图5是重编程过程中的大数据分析，主要采用RNA-seq方法。其中图A是Q-PCR实验，检测了5个makers，结果显示随着诱导天数的增加，markers表达量逐渐增加，说明诱导过程是逐步推进的，而不是一蹴而就。基于这样一个结果，作者对不同分化天数细胞进行RNA-Seq测序，并进行GO分析。结果表明从第0天开始，MEFs是逐步获得神经干祖细胞特性的。

在图D作者展示了神经干祖细胞和MEFs细胞特异性makers动态变化，其中神经干祖细胞markers是逐步上调的，而MEFs的markers是逐步下调的。E-G是采用CHIP-seq检测组蛋白修饰，显示ciNSLCs具有外胚层发育倾向 。H-L图主要证明ciNSLCs与原代分离的神经干细胞具有相似表观遗传特征。

图6是对分子机制的解析。A和B主要选用抑制bFGF信号通路的小分子化合物和Sonic Hedgehog通路的小分子化合物。发现抑制以上2个通路后，诱导效率几乎为0。并对以上两个信号通路下游的关键基因表达水平进行检测，显示基因在诱导早期高度表达后期被抑制。以上实验结果证实M9诱导ciNSLCs通过bFGF信号通路和Sonic Hedgehog通路。

接下来，作者从EIK和Gli2入手，分别检测诱导前后EIK的磷酸化水平（E-G），Gli2的全长蛋白表达水平 (H-J)。结果显示诱导后EIK的磷酸化水平升高，Gli2的全长蛋白表达水平升高。而采用ShRNA抑制上述两个关键蛋白表达水平导致诱导效率下降(K-L)。

接下来采用ChIP-seq方法证实EIK1和Gli2能与Sox2启动子结合。并采用Chip-PCR验证以上结果。