小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞体外编程为神经前体细胞

老庄走狗 2023-10-04 发布于浙江

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2023 Mar 20; 43(3): 360–367.

Chinese. doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.03.04

PMCID: PMC10122728

PMID: 37087579

Language: Chinese | English

小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞体外编程为神经前体细胞

Chemical reprogramming of human embryonic fibroblasts into neural progenitor cells in vitro

杨盼,^1,* 王圆圆,¹ 高群伟,¹ 刘阳,¹ 王翼,¹ 郭俣,² 刘长青,¹ and 刘高峰^1,^*

杨盼

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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王圆圆

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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高群伟

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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刘阳

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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王翼

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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郭俣

² 蚌埠医学院检验医学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Laboratory Medicine, Bengbu 233000, China

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刘长青

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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刘高峰

¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

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¹ 蚌埠医学院生命科学学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Life Sciences, Bengbu 233000, China

² 蚌埠医学院检验医学院，安徽蚌埠 233000, Bengbu Medical College School of Laboratory Medicine, Bengbu 233000, China

Corresponding author.

杨盼: moc.qq@5173317441; 刘高峰: nc.ude.cmbb@ymfgl

刘高峰，硕士生导师，副教授，E-mail: nc.ude.cmbb@ymfgl

Received 2022 Aug 10

Abstract

目的

通过小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞(HEFs)重编程为化学诱导神经前体细胞(ciNPCs)。

方法

HEFs重编程为ciNPCs涉及两个阶段，第1阶段是小分子组合诱导阶段，常氧条件下，将HEFs在含有小分子化合物组合VCR(VPA，CHIR99021，Repsox)的KSR培养基中培养15 d，HEFs形态发生变化，形成致密细胞集落。第2阶段是特异性诱导ciNPCs，将形成的细胞集落胰酶消化后，低粘附板中悬浮培养，可以形成ciNPCs神经球。采用CM-DiI染料标记P3代ciNPCs，并将其移植于6-OHDA法制作的帕金森大鼠模型右脑内侧前脑束(MFB)区，检测ciNPCs在PD大鼠脑内微环境中的存活、迁移以及分化状况。

结果

VCR组合诱导10 d细胞开始出现明显的聚集趋势，15 d时，形成致密的细胞集落。单层培养1×10⁵/孔中大约形成40个克隆，且AP染色呈阳性。将细胞集落消化后，低粘附板中悬浮培养培养2 d，可见大量神经球形成，即为第1代ciNPCs(P1代)。ciNPC高表达神经前体细胞(NPCs)特异性标记物(Nestin、Pax6和Sox2)，经体外神经特异性诱导分化，ciNPCs表达神经元特异性标记物Tuj1和星形胶质细胞特异性标记物GFAP。而且，P3代ciNPCs移植PD大鼠脑内4周后，可以分化为Tuj1⁺、GFAP⁺、TH⁺和GABA⁺细胞。

结论

VCR可以将HEFs重编程为ciNPCs，而无需引入外源性基因，为神经科学研究和神经退行性疾病的治疗提供有利的供体材料。

Keywords: 小分子化合物组合, 细胞重编程, 人胚胎成纤维细胞, 神经前体细胞

Abstract

Objective

To establish a protocol for reprogramming human embryonic fibroblasts (HEFs) into chemically induced neural progenitor cells (ciNPCs).

Methods

In the two-staged reprogramming of HEFs, the intermediate compact cell colonies were first chemically induced in KSR medium containing small-molecule compounds (VCR) for 15 days in normoxia, followed by the lineage-specific induction stage, in which the compact cell colonies were digested with 0.25% trypsin and the cells were cultured in low adhesion plates. After formation of a large number of free-floating neurospheres 2 days later, the ciNPCs were labeled with CM-DiI and transplanted into rat models of Parkinson's disease (PD)to observe the survival, migration and differentiation of the cells in PD brain.

Results

After induction with VCR for 10 days under normoxic condition, compact cell colonies occurred in HEF cultures (approximately 40 colonies in each well containing 1×10⁵ HEFs), and most of the colonies expressed high levels of alkaline phosphatase. A large number of free-floating neurospheres formed 2 days after passage and were defined as P1 ciNPCs. These ciNPCs exhibited typical neurosphere-like structures and expressed NPC-specific markers (nestin, Sox2, and Pax6). Under neuronal or glial differentiation condition, the ciNPCs expressed the neuron-specific marker Tuj1 and the astrocyte-specific marker GFAP. These ciNPCs could differentiate into Tuj1⁺, GFAP⁺, TH⁺ and GABA⁺ cells 4 weeks after transplantation into the brain of PD rats.

Conclusion

HEFs can be directly reprogrammed into ciNPCs using smallmolecule compounds without the need of introducing exogenous genes. This success may provide a solution to the shortage of donor materials for neuroscience research and treatment of neurodegenerative diseases.

Keywords: small molecule compounds, cell reprogramming, human embryonic fibroblasts, neural progenitor cells

细胞替代疗法已成为治疗神经性疾病一项非常有前途的措施，研究表明，神经细胞移植能有效治疗神经退行性病变^[1-3]。成纤维细胞是一种易获得、耐受性好，便于细胞重编程潜在的初始细胞^[4]。利用特定的因子将体细胞诱导产生神经前体(ciNPCs)或神经干细胞(NSCs)为神经退行性疾病如帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、阿尔兹海默症(AD)的细胞治疗提供了新的途径^[5]。有研究证实，利用过表达神经谱系特异性转录因子或采用细胞重编程转录因子，与小分子化合物相结合，可以直接将体细胞重编程为神经元或化学诱导的多能干细胞样细胞(ciPSLC)^{[6, 7]}。但由于外源性基因引入和病毒转染存在一定的安全性问题，限制了它们在细胞治疗中的应用。而小分子化合物具有安全性高、易获得、易操作与高细胞渗透性等优势，在不引入任何外源因子的情况下，通过化学介导实现细胞重编程已得到广泛关注^{[8, 9]}。

有研究报道利用VPA、CHIR99021、Repsox 3种化合物，在生理性缺氧条件下可以将小鼠成纤维细胞重编程成为NPCs，但此诱导结果效率不高，容易因多能性基因被激活而出现致瘤性风险^[10]。之后，我们团队对诱导方案进行优化，通过增加白血病抑制因子(LIF)的浓度，在生理性缺氧条件下成功地将大鼠成纤维细胞重编程为NPCs。然而，这两项研究并没有完成在常氧条件诱导下获得高纯度的NPCs^[11]。因此，我们采用人类成纤维细胞作为初始细胞，通过VCR 3种小分子化合物在常氧条件下成功地将人胚胎成纤维细胞(HEFs)重编程为高纯度的ciNPCs。

对于PD、HD、AD和中风等神经退行性疾病的研究已受到广泛关注，药物治疗虽然可以改善患者的疾病症状，但不能完全阻止病情发展^[12]。NPCs是能够自我更新、具有多向分化潜能的细胞，在移植到神经退行性疾病患者脑内可以分化为多种功能性神经元，并整合到中枢神经系统的受损部位从而改善其临床症状^[13]。利用小分子组合将体细胞诱导为具有发育潜力的NPCs，对于治疗神经退行性疾病具有广泛的应用前景。本研究利用VCR 3种小分子化合物组合在常氧(21% O₂)将HEFs重编程为ciNPCs，以期为神经退行性疾病的细胞替代疗法提供新的细胞来源。

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1. 材料和方法

1.1. 实验动物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量180~220 g，购买于安徽医科大学实验中心。在清洁级别动物房中进行饲养，环境温度保持为24~26 ℃，饲养密度≤5只/笼，自由活动。商品化颗粒饲料用于喂食，饮水瓶和垫料定期消毒更换。实验动物操作按照我国《实验动物福利伦理审查指南(GB/T 35892-2018)》要求，获得蚌埠医学院动物福利伦理委员会批准(批准号2020-025)。

1.2. 主要试剂

DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、Knockout DMEM培养基、Neurobasal培养基、0.25% 胰蛋白酶、非必需氨基酸(NEAA)、L-Glutamax、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、敲除血清替代物(KOSR)、B27、胎牛血清(FBS)、肝素(Gibco)，神经基础培养基、神经增值补充剂、神经分化补充剂(Stem cell technologies)，丙戊酸钠(VPA)、6- 羟基多巴胺(6-OHDA)、多聚鸟氨酸(PLO)、TritonX-100(Sigma)，CHIR99021、Repsox (Selleckchem)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) (R&D)，LIF、IGF-1、rat EGF(PeproTech)，N2(Gemini)，青霉素-链霉素、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液、中性红染液、BCIP/NBT碱性磷酸酶(AP)显色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)，维生素C(BioSharp)、兔抗Pax6、兔抗Synaptophysin、兔抗Sox2、鼠抗Nestin、鼠抗Tuj1购买于abcam，兔抗GFAP(Bioss)，驴血清(NDS)、驴抗兔Cy3(Jackson Lab)，驴抗鼠Alexa Fluor 488、CellTracker^TM CM-DiI Dye、抗荧光淬灭剂(Invitrogen)。。

1.3. 细胞培养

人胚胎成纤维细胞(HEFs)购自中科院细胞库(北京总部)，取生长状态良好的HEFs在含有10% FBS、1% NEAA和1% 双抗的DMEM高糖培养基中培养，待细胞长满80%~90%时，采用0.25 %胰蛋白酶-EDTA消化继续传代培养。

1.4. HEFs诱导产生ciNPCs

1.4.1. VCR组合化学诱导HEFs

将生长状态良好的HEFs以1×10⁵/孔接种于被0.1%明胶包被的十二孔板内，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养2 d之后，更换含小分子组合VCR的KSR培养基(knockout DMEM培养基+0.5 mmol/L VPA+3 μmol/L CHIR99021+1 μmol/L Repsox+15% KOSR+1% GlutaMAX+1% NEAA+1% sodium pyruvate +10000 U/mL leukemia inhibitory factor (LIF)+1% 双抗+0.1 mmol/L β-mercaptoethanol) 培养15 d，密切观察细胞形态变化与细胞集落形成，培养基每5 d更换1次。

1.4.2. 特异性诱导ciNPCs产生

将诱导15 d所形成的细胞集落胰酶消化后，分别接种于12孔板和低粘附板中，更换NEM培养基(神经基础培养基+神经增值补充剂+30 ng/mL肝素+20 ng/mL bFGF+20 ng/mL EGF+1% 双抗)，常氧条件下进行单层和悬浮培养。单层培养2~4 d出现双极样细胞，4~7 d时可见大小不一的神经球形成。之后对神经球用4%多聚甲醛(PFA)室温固定10 min，进行AP染色，并用0.5%中性红染液复染细胞核与细胞质。悬浮培养时，传代后2 d即可见大量神经胚球的产生，获得第1代ciNPCs。当ciNPCs直径达到100~150 μm时可以传代培养，每隔2 d半量换液。

1.5. ciNPCs特异性标志物的鉴定

将培养状态良好的ciNPCs接种于PLO和Laminin包被的无菌爬片上，更换含血清培养基培养6~8 h，待其贴壁后进行免疫荧光检测。采用4% PFA固定10 min，1×PBS清洗3次，然后依次加入封闭液①(1×PBS+2% BAS+10% NDS+1% TritonX-100)室温放置8 min，封闭液②(1×PBS+2 %BAS+10% NDS)室温封闭1 h。1× PBS清洗3次，进行一抗4 ℃孵育过夜。使用的一抗包括鼠抗Nestin(1∶300)，鼠抗Tuj1(1∶300)，鼠抗GABA (1∶100)，兔抗Olig2(1∶500)，兔抗Pax6(1∶50)，兔抗Sox2(1∶300)，兔抗GFAP(1∶100)，兔抗Syn(1∶300)。次日，1×PBS清洗3次，加入荧光标记的二抗室温避光孵育1 h，使用的荧光二抗包括Alexa Fluor 488(1∶500)，Cy3(1∶800)，之后用DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜(Olympus)和共聚焦显微镜观察(Olympus，FV-1200MPE SHARE)观察染色结果。每组实验均进行3次独立重复。

1.6. ciNPCs体外分化培养及分化潜能的鉴定

将培养状态良好的ciNPCs神经胚球接种于已被PLO和Laminin包被的无菌爬片上，待细胞贴壁后更换神经诱导培养基进行体外分化培养：(1)细胞自发分化：将细胞于神经细胞基础诱导培养基(神经基础培养基+ 神经分化补充剂)，培养30 d，每隔2~3 d半量换液；(2) 神经元诱导分化：更换神经元分化培养基(神经基础培养基+神经分化补充剂+1% N2+2% B27+10 ng/mL IGF +10 ng/mL GDNF +1 μmol/L cAMP +10 ng/mL BDNF+200 µmol/L AA)，培养30 d，每隔2~3 d半量换液；(3)向胶质细胞诱导分化：更换神经胶质细胞诱导培养基(基础诱导培养基+1% N2+2% B27)，培养14~28 d。认真观察细胞形态变化及分化情况，通过免疫荧光分别检测神经元特异性标记物Tuj1与胶质细胞特异性标记物GFAP的表达。

1.7. ciNPCs定向移植于PD大鼠大脑

将6~8周龄，体质量为180~220 g的雄性SD大鼠麻醉后，利用脑立体定位仪固定大鼠头部，通过向大鼠右侧大脑两个位点(①AP-4.4 mm，ML-1.2 mm，DV- 7.8 mm；②AP-4.0 mm，ML-0.8 mm，DV-8.0 mm)注射6-OHDA制备PD大鼠模型。建模成功2周后，相同两个位点，向PD大鼠脑内注入CM-DiI标记的带红色荧光的ciNPCs(P3，1×10⁵/8 μL)。细胞移植PD大鼠4周后，将PD大鼠进行心脏灌注取脑，冰冻切片后免疫荧光检测GFAP与Tuj1特异性抗原表达，荧光显微镜观察ciNPCs在大鼠脑内的存活、迁移及分化状况。

1.8. Western blot检测

取HEFs、ciNPCs和NSCs 3组样品的细胞分别加蛋白裂解液，临用前加入蛋白酶抑制剂，利用超声波破碎仪进行超声，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，收集裂解液上清，然后进行蛋白定量。各组样品均取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE，电泳后转移至PVDF膜上，应用Nestin、Sox2和Pax6抗体孵育并与相应的二抗反应，化学发光法检测抗原抗体结合区条带，对不同分子量的蛋白表达情况进行分析。

1.9. PCR检测

取HEFs用RNA提取试剂盒提取RNA，检测RNA样品的浓度，采用Prime ScriptTM RT Master Mix试剂盒将RNA逆转录成cDNA，加入提前设计好的引物进行扩增，将得到的引物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后上机分析表达情况。

1.10. 统计学分析

采用Graphpad 8.0.1软件进行统计学分析，所得的实验数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析检验，以P < 0.05认为差异具有统计学意义。

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2. 结果

2.1. 人胚胎成纤维细胞初始细胞验证

在初始细胞的特征鉴定中，免疫荧光结果显示，NPCs标记物Nestin、神经元标记物Tuj1、星形胶质细胞标记物GFAP、少突细胞标志物Olig2均未表达(图 1A)。同时，RT-PCR检测表明成纤维细胞特异性基因S100A4、COL1A1均高表达，而NPCs特异性标记基因NESTIN，多潜能性基因SOX2与OCT4未表达(图 1B、C)。

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图 1

用于化学重编程初始细胞HEFs的鉴定

Identification of HEFs for subsequent chemically induced reprogramming. A: Immunofluorescence detection of neural stem cell marker (nestin), neuron marker (Tuj1), astrocyte marker (GFAP), and oligodendrocyte marker (Olig2) in HEFs (Original magnification: × 400). B: RT-PCR detection of fibroblast-specific markers S100A4 and COL1A1. C: RT-PCR detection of NPCs markers nestin and multipotential marker genes SOX2 and OCT4.

2.2. 小分子混合物组合VCR重编程HEFs为ciNPCs

HEFs在第1阶段VCR诱导过程中(图 1A)，诱导10 d细胞出现聚集趋势，诱导15 d时，聚集趋势更加显著，可见大小不一的细胞集落形成(图 2B)。在第2阶段特异性诱导ciNPCs时，悬浮培养1 d可以看到部分神经球形成，10 d即可见神经球球体饱满，数量明显增多，收集后即为P1代ciNPCs，球体直径达100 μm左右(图 2C)。单层培养2~4 d部分细胞出现聚集趋势，形成少量的神经球，大量的NPCs样双极细胞形成(图 2D白色箭头)。培养置4~7 d时，聚集紧密、大小不一的克隆团形成，有时可见部分胚球已脱落漂浮(图 2D)，大约1×10⁵/孔中有40个克隆，且AP染色呈阳性(图 2E)。

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图 2

小分子化合物组合VCR诱导HEFs产生ciNPCs

Induction of HEFs reprogramming into ciNPCs using a chemical cocktail (VCR). A: The induction system for reprogramming HEFs into ciNPCs. B: Morphological changes of the cells during different stages of induction. C: Formation of ciNPCs in suspension culture. D: NPCs-like cells and ciNPCs after monolayer culture for 2-7 days. E: Formation of ciNPCs in monolayer culture with positive AP staining.

2.3. ciNPCs特征鉴定与增殖

免疫荧光检测ciNPCs表达内源性NPCs特异性标记物结果表明，ciNPCs能够高表达NPCs标记物Nestin、Sox2和Pax6(图 3A)，具有典型的NPCs特征。通过Western blot检测表明，与HEFs相比，ciNPCs中重编程和多潜能转录因子Sox2、Nestin与Pax6的表达量显著提高，与NSCs具有明显的相似性(图 3B，P < 0.01)，这一结果与免疫荧光结果相一致。同时，为进一步检测ciNPCs的自我更新能力和特征，本研究将获得的ciNPCs进行传代培养，发现其可以连续传代至P7代，并保持良好的神经球细胞形态，且P2和P7代ciNPCs的球体大小和数量无明显差异(图 3C、D，P>0.05)。

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图 3

ciNPCs的特征鉴定与自我更新

Characterization and self-renewal of the ciNPCs. A: The ciNPCs obtained were induced to express Nestin⁺ Sox2⁺ and Nestin⁺ Pax6⁺, and the nuclei were counterstained with DAPI (Sox2-CY3, Pax6-CY3 and Nestin-488 staining. B: Western blotting of HEFs, ciNPCs and NSCs proteins. C, D: Comparison of neurospheres and spheroid size of ciNPCs in passage 2 (P2) and 7 (P7) in suspension culture.

2.4. ciNPCs体外分化能力的鉴定

将P2代ciNPCs在神经诱导培养基中培养15~30 d后，经免疫荧光检测发现在细胞的分支上有蘑菇状神经树突棘的形成(图 4A，白色箭头)，且表达Nestin与神经元特异性抗原Tuj1+，表明ciNPCs在自分化培养时，存在向神经细胞分化的潜在趋势。在神经元诱导分化培养基中培养30 d，对神经细胞特异性标记物进行检测，结果显示ciNPCs诱导分化后呈神经元形态，并表达神经特异性标记Nestin，Tuj1(图 4B)，突触蛋白(Syn)与微管关联蛋白2 (Map2，图 4C)。而在胶质细胞分化培养基中诱导培养14 d后，大部分ciNPCs表达星形胶质细胞特异性标记物(GFAP，图 4D)。

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图 4

ciNPCs体外分化能力的检测

Differentiation of ciNPCs in vitro. A: ciNPCs express the neuronspecific marker Tuj1 after 30 days of culture in cell spontaneous differentiation medium. B: ciNPCs express neuron marker Tuj1 after culture in neural differentiation medium for 30 days. C: ciNPCs express Syn (Green) and Map2. D: ciNPCs express astrocyte marker GFAP after 14 days of culture in glial cell medium.

2.5. ciNPCs体内功能鉴定

将P3代冻存的ciNPCs复苏培养后，发现神经球依旧保持良好的生长状态与增殖能力。将CM-DiI标记的ciNPCs细胞移入PD大鼠脑内4周后，对大鼠脑组织冰冻切片进行免疫荧光检测，结果显示，CM-DiI标记的细胞在大鼠脑内能够存活并形成明显的移植物区域，并有部分细胞发生迁移(图 5A)。多数被CM-DiI标记的细胞显示Tuj1、GFAP阳性，同时在脑内检测到ciNPCs表达不同类型的神经元，多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)、GABA能神经元标记物γ-氨基丁酸(GABA) 呈阳性(图 5B)。且Tuj1⁺、GFAP⁺、TH⁺及GABA⁺细胞散布于移植区域各处，并整合于宿主脑组织中形成联系。

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图 5

ciNPCs在宿主体内的存活及分化检测

Survival and differentiation of ciNPCs in the brain of PD rats. A: Survival of ciNPCs in PD rat brain. B: The transplanted cells can differentiate into Tuj1⁺ and GFAP⁺ astrocytes and TH +and GABA+neurons in PD rat brain.

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3. 讨论

2014年，裴钢等^[10]在低氧(5% O₂)条件下，利用VCR小分子化合物组合将小鼠成纤维细胞重编程为NPCs。在此基础上，我们在低氧、常氧条件下分别对HEFs进行诱导，发现不同氧气条件下均可以将HEFs重编为ciNPCs，且重编程效率尚无较大差异，因此我们选择了更便于重编程的常氧环境来进一步研究体细胞化学重编程的效用。而Tang等^[14]于2018年也通过小分子化合物(VCR)成功将小鼠成纤维细胞直接重编程为NSCs。在此基础上，本研究利用VCR 3种小分子化合物鉴定了一种从HEFs中产生ciNPCs的细胞重编程方法。而且，获得的ciNPC和内源NPCs相比，在细胞形态、细胞特性、自我更新和分化为神经元、胶质细胞的潜能方面具有相似的特征。由此表明，化学重编程在实现细胞命运转化方面是一种重要的潜在方法。

小分子化合物可以提高重编程效率，取代部分转录因子促进细胞谱系转化，在体细胞重编程中扮演着重要角色^{[8, 15]}。VPA的主要分子靶点是HDAC，HDAC会使染色质凝聚，减少基因的表达，通过对HADC的抑制，有效增强细胞转录活性，提高重编程效率^[16]。在体细胞重编程中，VPA通过染色质修饰可以提高iPSCs效率，而VPA的去除，会使Nestin+细胞的数量减少，这提示VPA参与提高重编效率可能是由于组蛋白乙酰化和去乙酰化的调控作用^[5]。同时，VPA具有的神经保护作用，可以通过AKT/GSK3-β信号通路的激活所介导，有效对抗中枢神经损伤后的细胞凋亡及炎症反应^[17]。在脑损伤时，VPA还能够上调和脑源性营养因子(BDNF)和胶质源性营养因子(GDNF)的生成，增加神经元存活率^{[18, 19]}。此外，VPA通过对HADC的抑制，可以抑制重编程诱导的细胞衰老以及通过抑制p16/p21通路增加细胞增殖并抑制细胞死亡^[20]。

CHIR99021是一种糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂，在多能干细胞诱导神经元发育中常用。CHIR99021在促进体细胞重编程中，常通过激活Wnt信号通路而发挥作用。2021年，Lorenz Studer团队和Viviane Tabar团队使用不同浓度的CHIR99021通过双相激活Wnt信号通路，成功从人多能干细胞(hPSCs)中高效诱导出中脑多巴胺神经元(mDA)，将冷冻保存的mDA前体神经元移入PD大鼠模型中，发现有效恢复了大鼠损毁侧的旋转行为^[21]。QI研究团队发现CHIR99021在HD患者诱导性多能性干细胞(iPSCs)分化的神经元中，可以有效增强线粒体功能和改善神经元形态，保护神经元并缓解HD病情发展^[22]。

Repsox是一种选择性的TGFβ R-1/ALK5抑制剂，在小鼠胚胎成纤维细胞诱导为iPSCs中可以替代Sox2和c-Myc，提高重编程效率^[23]。同时，抑制TGF-β信号也有助于从胚胎干细胞(ESCs)或iPSCs进行有效地神经分化^[24]。最近的研究发现，Repsox可以增强牛骨髓间充质干细胞(bBMSC)的增殖、存活和成骨性，并通过抑制TGF-β/Smad信号传导来调节bBMSC的体外维持和分化^[25]。我们在重编程中使用VCR 3种小分子成功将HEFs诱导为ciNPCs，此过程可能通过抑制HDACs、TGF-β、GSK-3等信号通路调控多能性转录因子的表达，进而提高体细胞重编程效率，但具体机制暂不明确，还有待研究。

我们通过VCR组合获得的HEFs-ciNPCs在细胞形态上具有典型NSCs的神经球样结构，在细胞特征上，其高表达NPCs特异性标记物Nestin、Sox2和Pax6，在自我更新能力上，经连续传代培养至7代后，ciNPCs仍可以形成球体饱满的神经球。ciNPCs体外诱导培养，可以分化为Tuj1+与GFAP+细胞。将ciNPCs移入PD大鼠4周后，免疫荧光检测到在移植区被CM-DiI标记的细胞依旧存活并形成明显的移植物区，且移入的细胞表达Tuj1⁺、GABA⁺和GFA^P+细胞，部分细胞会发生远距离迁移。移植的HEFs-ciNPCs可以在大鼠脑内存活并可以分化为神经元及胶质细胞。

综上所述，本研究利用3种小分子组合将HEFs直接重编程为ciNPCs，生成的ciNPCs具有一定的自我更新能力且具备体内外分化为神经元和胶质细胞的潜能，有助于开发潜在的神经退行性疾病和损伤的治疗方法，为NPCs/NSCs移植治疗神经系统性疾病提供有效的细胞来源。

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Biography

杨盼，硕士，E-mail: moc.qq@5173317441

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Funding Statement

国家自然科学基金(81771381)；安徽省高校自然科学基金重点项目(KJ2021ZD0085，KJ2021A0774，KJ2021A0784)；安徽省重点研究与开发计划项目(2022e07020030，2022e07020032)；蚌埠医学院研究生科研创新计划项目(Byycxz21055)；国家级大学生创新创业训练项目资助(202110367043，202110367044，20210367058，202110367059)

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Funding Statement

Supported by National Natural Science Foundation of China (81771381)

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