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作者：米粒儿 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 上周更新的文献精读秋季班第十讲由larry老师主讲表观遗传研究套路。选取文献来自于Nature Communications（IF2016=12.123）。 文章的主角是一个重要的表观遗传调节因子G9a，专门负责核小体里面第三号组蛋白上第九号赖氨酸甲基化的甲基化酶。在早期的研究里，发现G9a对于发育分化有着重要的作用。最近这几年，越来越多的研究倾向于认为G9a是一个致癌基因，在大部分的癌症组织里面，G9a都是高表达的。 细胞会通过一系列的方法保持细胞内铁离子含量的平衡，也就是细胞的铁稳态。如果细胞铁稳态被打破，就会导致细胞功能异常，并极有可能在细胞癌变里扮演重要的角色。 基于以上背景，作者提出本文科学假设（1） G9a表观抑制亚铁氧化酶（HEPH）的表达。（2）亚铁氧化酶的失调引起细胞内铁稳态失衡，从而影响乳腺癌细胞的生长增殖。（3）G9a联合YY1以及HDAC1形成复合物来抑制亚铁氧化酶的表达。 结果总览 本文主要结果呈现在图1-6中，系统的讲述了G9a，亚铁氧化酶（HEPH）和内稳态三者的关系。其中图1通过体内/体外实验模型阐述了G9a在乳腺癌增殖中的作用，在图2中作者引入HEPH，重点阐释G9a对HEPH的调节作用。图3则引入细胞铁稳态，阐述G9a通过HEPH调节细胞铁稳态。 在解释完G9a，HEPH和细胞铁稳态三者关系后，作者又回到增殖这一表型，详细表述了G9a是如何通过调节细胞铁稳态影响细胞增殖的。而图5和图6则是细致描绘，G9a通过怎样的表观遗传学机制调控HEPH。这一部分是文章的亮点，是希望学习表观遗传学的学员们应该重点关注的。 数据解构 图1主要通过体外及体内模型验证G9a抑制乳腺癌生长及增殖 在多株乳腺癌细胞系中敲低G9a后，发现乳腺癌细胞集落形成以及增殖能力受到抑制（图a）；而过表达G9a后，乳腺癌细胞集落形成以及增殖能力增强。 此外敲低G9a或者小分子抑制G9a酶活性后，细胞周期阻滞在G1期（图c和图d）。 在图e中作者测定了G9a小分子抑制剂（UNC0638和BIX01294）的IC50。结果显示，在一系列乳腺癌细胞中，IC50普遍偏低，证明G9a可能是乳腺癌潜在的治疗靶点。 而图f则是体内实验的结果，采用裸鼠皮下注射成瘤方法，发现敲低G9a降低体内致瘤性。 图2主要阐述G9a调节亚铁氧化酶HEPH的表达 在图1的基础上，作者在图2引入了HEPH这一分子作为G9a发挥作用的下游靶点。作者是如何选到HEPH这一分子呢？采用芯片分析基因表达谱，分析敲低G9a后表达谱的变化情况。列出了变化最为明显的17个基因，HEPH便在其中因此选取该分子为靶点。 筛选到靶分子之后，下一步自然是证实敲低G9a后确实影响HEPH表达。在这里作者主要选择了MCF-7，MDA-MB-231, ZR-75-30三个细胞系，敲低G9a/小分子抑制G9a酶活性，采用qPCR和western blot方法检测HEPH的mRNA和蛋白表达。结果显示G9a活性抑制后，HEPH表达升高。
接下来，作者在一系列乳腺癌细胞系中检测G9a和HEPH表达水平，发现二者显著负相关。
接下来，作者在乳腺癌组织切片中采用免疫组化方法也证实了以上结论。
图3 敲低G9a使HEPH在细胞膜上高表达，并导致血浆铁储存库LIP减少 免疫细胞学分析和WB实验证明，敲低G9a或者小分子抑制G9a酶活性使HEPH在细胞膜上的表达水平升高。
敲低G9a上调HEPH，并使细胞的亚铁氧化活性增强。
在对钙黄绿素分析也证实，敲低G9a或者小分子抑制G9a活性降低细胞的不稳定性铁储存量。
而高表达G9a后，增加细胞的不稳定性铁储存量，高表达HEPH则相反。
图4 G9a通过调节细胞内铁储存量来控制乳腺癌生长及增殖 图a和b中，敲低G9a或者小分子抑制G9a酶活性课抑制乳腺癌细胞生长增殖与凋亡，而充足的铁离子供应则可使其恢复原样。
敲低HEPH使细胞内铁储存量增多，并抑制乳腺癌细胞生长。
敲低G9a课减少细胞内铁储存量，并抑制乳腺癌细胞生长增殖，而敲低HEPH则可使细胞恢复原状。
图5 G9a通过其组蛋白甲基转化酶活性来表达调控HEPH G9a是一种蛋白甲基化转移酶，所以首先要证明组蛋白甲基化转移酶活性是否影响HEPH表达。在几乎所有组蛋白甲基化转移酶中，都包含一个甲基化活性结构域SET。 作者在第一部分将Set结构域变异，检测HEPH表达。发现敲低G9a后，HEPH表达升高，过表达后HEPH表达降低，而在过表达G9a后将Set结构域变异后，HEPH表达无显著降低。
下一部分，作者进行CHIP-PCR实验，确定了HEPH启动子-870到-1250这一段上有组蛋白甲基化发生，进一步证明了G9a可通过组蛋白甲基化来调控HEPH表达。
而敲低G9a或者小分子抑制G9a酶活性都可使HEPH启动子上H3K9me2程度降低，而高表达G9a，趋势相反。
而敲低G9a或者小分子抑制G9a酶活性都可以转录抑制HEPH启动子活性，该部分采用了荧光素酶报告基因检测实验。
图6 G9a与YY1和HDAC1形成复合物以调控HEPH的表达 G9a通常与其他蛋白形成复合物发挥其功能，那么在HEPH调控过程中G9a与什么蛋白形成复合物呢？这是图6需要回答的问题。 首先作者分析了G9a和HEPH结合序列，在该序列中发现了YY1的两个结合位点。YY1是一种转录因子，在不同的条件下可能激活也可以抑制蛋白表达。 作者发现敲低YY1可上调HEPH表达，同时敲低YY1及G9a可协同上调HEPH（图a）。分别高表达G9a或者YY1可降低HEPH启动子活性，同时高表达G9a和YY1具有协同作用（图b）。分别高表达G9a同时敲低YY1可恢复HEPH表达。同时高表达G9a和YY1可协同下调HEPH。
高表达G9a和HDAC1协同抑制HEPH启动子活性（图d）。高表达G9a可以下调HEPH，此时敲低HDAC1则HEPH表达回复。同时高表达G9a和HDAC1则协同抑制HEPH表达。小分子抑制HDAC1与G9a活性可协同上调HEPH的表达。
敲低G9a和YY1可使HEPH启动子的H3K9me2程度降低；敲低YY1也可以减少G9a与HEPH启动子结合（图f）。高表达G9a可以令HEPH启动子上结合的HDAC1增多；此时敲低HDAC1则令HEPH启动子上G9a和YY1的结合减少。
图7则是临床数据结果，表明高表达水平的G9a以及低表达水平的HEPH患者具有较低的生存率。 |
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