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解螺旋公众号·陪伴你科研的第2091天
最近大家都追捧外泌体、非编码RNA等热点，但并不是什么分子新就一定要做什么，选择最适合自己的，课题组有一定工作基础的，任何分子类型都可以胜任文章基金的需求。酸菜大大说过蛋白作为最后是执行功能的单位，研究蛋功能基因永远不过时，把细节做到位，功能基因也能发一篇很好的文章。废话不多说，接下来带大家一起欣赏一篇HEPATOLOGY的文章，感受一下功能基因的顶级套路。文章标题是“PRDM8 Exhibits Antitumor Activities Toward Hepatocellular Carcinoma by Targeting NAP1L1“。首先，主变量分子是PRDM8，其功能是抑癌，疾病是肝癌，机制是能够靶向结合NAP1L1基因。从题目看本文就是一个分子+分子二元结构，但通过摘要发现PI3K/AKT/mTOR通路。因此，我们得出科学假设：分子PRDM8通过靶向分子NAP1L1调控PI3K/AKT/mTOR通路从而抑制肝癌发生发展，这算一个分子+分子+通路的三元直接机制结构。本文包括了分子、细胞、动物、组织四个维度，由于图片数量限制，正文只有8个figures，故补充材料里的图表也显得格外的重要，内容可以分为4部分：第一部分（组织水平），包括figure1、S1，TableS1、S2，论证PRDM8分子在肝癌组织中的表达情况；第二部分（细胞水平），包括figure2、3、S2、S3，过表达和沉默PRDM8一正一反表型验证；第三部分（动物水平），包括figure4，5，通过移植瘤、转移瘤模型进行表型验证；第四部分（分子水平），包括figure6、7、8、S5、S6、S7此部分为机制研究。A、B图：PCR显示60对配对临床样本中，PRDM8 mRNA在肝癌组织中的表达量显著低于癌旁组织；C图：westernblot显示PRDM8蛋白在肝癌组织中的表达量显著低于癌旁组织；D图：免疫组化显示肝癌组织中PRDM8的表达降低；E图：预后生存曲线图提示PRDM8高表达的患者的无复发生存率和总体生存率均高于PRDM8低表达的患者。补充材料FigureS1中A图：398对石蜡切片进行免疫组化检测，提示PRDM8在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织；B图：组织芯片检测又一次验证PRDM8在肝癌组织中的表达是下降的。首先，在FigureS2A、B图中，作者检测了PRDM8mRNA及蛋白在7肝癌细胞株中的表达，结果显示相比较LO2细胞，PRDM8在SMMC7721和YY8103细胞株中表达相对更低，故对其进行了过表达操作；而在Focus和HepG2细胞株中表达相对高于其它细胞株，故对其进行了沉默操作；C、D、E图：从转录及蛋白水平验证操作效率。Figure2，过表达PRDM8可以抑制肝癌细胞增殖、转移及侵袭
A图：CCK8检测结果显示PRDM8过表达后肝癌细胞增殖减慢；B图：克隆形成实验显示PRDM8过表达后克隆形成数目减少；C图：划痕实验显示PRDM8过表达后细胞迁移能力减弱；D图：Transwell实验显示PRDM8过表达后细胞侵袭能力减弱；Figure3，PRDM8能够调控G1-S期转化，并促进细胞凋亡
FigureS3显示PRDM8敲减后可以促进肝癌细胞增殖、转移及侵袭，做到了“一正一反”。A图：PRDM8过表达后，肿瘤体积变小，重量减少；C图：动物标本HE染色、IHC检测PRDM8及增殖markerki-67、TUNEL染色显示在过表达PRDM8的移植瘤组织中细胞增殖减少、凋亡增加。A图：光量子通量检测法显示PRDM8过表达抑制转移的发生；B图：光量子通量检测法显示敲减PRDM8可促进转移的发生；C图：尾静脉注射观察肺部结节，PRDM8过表达减少了肺部结节数量；D图：尾静脉注射观察肺部结节，敲减PRDM8增加了肺部结节数量；F图：生存曲线图显示PRDM8过表达组裸鼠总体生存率高于对照组；G图：生存曲线图显示敲减PRDM8后裸鼠的总体生存率低于对照组。Figure6，PRDM8抑制PI3K/AKT/mTOR通路
A图：westernblot显示PRDM8过表达后AKT、mTOR磷酸化减少；B图：western blot显示敲减PRDM8后AKT、mTOR磷酸化增多；C图：western blot显示PRDM8过表达后细胞周期、凋亡、肿瘤转移相关蛋白的变化，其中细胞周期G1期标志物（Cyclin D1,Cyclin E1, CDK2,CDK4, CDK6）降低，抑癌基因p27增加，转移相关标志物（MMP2,MMP9）降低，血管内皮因子VEGF降低，凋亡相关标志物bcl-2下降，而剪切后Caspase-3和Bax增多，提示PRDM8过表达后细胞周期停滞于G1/S期，细胞凋亡增加，转移能力减弱；D图：western blot 显示敲减PRDM8后得到了C图相反的结果。Figure7，PRDM8通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌
A图：加入IGF-1后，AKT、mTOR磷酸化增加，通路激活；B图：PRDM8过表达后加入通路激活剂，细胞增殖能力增加；C图：PRDM8过表达后加入通路激活剂，细胞迁移能力增加；D图：PRDM8过表达后加入通路激活剂，细胞侵袭能力增加；E图：加入通路激活剂后，G1期细胞比例减少，S期细胞比例增加；FigureS4显示PRDM8敲减的细胞中加入通路激动剂，同样可以回复表型。B图：co-IP运用PRDM8抗体验证与分子NAP1L1结合；C图：co-IP运用NAP1L1抗体验证与分子PRDM8结合；D图：PCR检测60对配对临床样本中NAP1L1mRNA表达水平，提示NAP1L1在肝癌组织中表达增高；E图：相关性分析显示PRDM8与NAP1L1表达呈负相关；F图：免疫荧光显示PRDM8与NAP1L1的定位相似；G图：NAP1L1在PRDM8过表达的细胞中表达减少；H图：NAP1L1在PRDM8敲减的细胞中表达增加；FigureS5，PRDM8通过NAP1L1抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性从而抑癌
A图：在PRDM8过表达SMMC7721细胞中过表达NAP1L1；B图：同时过表达PRDM8和NAP1L1后PI3K/AKT/mTOR通路被激活；C、D、E、F图：同时过表达PRDM8和NAP1L1后细胞增殖、迁移及侵袭能力增加；G、H图：同时过表达PRDM8和NAP1L1后S期细胞比例增加、细胞凋亡减少。FigureS6，PRDM8通过NAP1L1抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性从而抑癌
A图：在PRDM8敲减的HepG2细胞中敲减NAP1L1；B图：同时敲减PRDM8和NAP1L1后PI3K/AKT/mTOR通路被抑制；C、D、E、F图：同时敲减PRDM8和NAP1L1后细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱；G、H图：同时敲减PRDM8和NAP1L1后G1期细胞比例增加、细胞凋亡增加。FigureS7，过表达PRDM8同时敲减NAP1L1可以协同抑癌
A、B图：过表达PRDM8的同时敲减NAP1L1后细胞增殖、侵袭能力进一步减弱；C图：根据以往研究报道，NAP1L1敲除后的肝星状细胞出现GAB1分子的下降，而GAB1被报道是PI3K/AKT/mTOR通路重要的上游调节因子，故作者猜测NAP1L1是通过调控GAB1激活PI3K/AKT/mTOR通路，westernblot结果显示NAP1L1过表达后GAB1水平升高，NAP1L1敲减后GAB1水平降低。总结一下，本文是一个分子+分子+通路三元变量结构，论证了主变量分子PRDM8通过与NAP1L1结合调控PI3K/AKT/mTOR通路从而抑制肝癌的发生发展，其中包括一个分支，NAP1L1可能通过调控GAB1从而调控PI3K/AKT/mTOR通路，分为以下三步论证：单变量论证：PRDM8抑制肝癌增殖、迁移及侵袭，促进G1/S期停滞、细胞凋亡，有多株高表达/低表达细胞模型，细胞动物双重论证，但唯一的缺陷是每个表型缺乏多实验验证；二元变量论证：PRDM8通过NAP1L1抑制PI3K/AKT/mTOR活性从而抑癌，PRDM8调控通路，PRDM8调控NAP1L1，PRDM8调控通路、表型通过NAP1L1，有上下调控关系，有“反正正”、“反反反”表型回复；直接作用论证：首先用IP找到结合的分子，然后用co-IP正反验证分子间的结合。本文之所有能发这么高的分数，首先，主变量分子存在一定创新性，之前只报道过2篇文章，但在肝癌中的作用是首次报道；
其次，态度端正，本文最大的特色就是论证结构非常完整，包括了临床、细胞、动物、分子四个维度，而且每个维度都从多个角度来验证，临床水平包括配对样本60对、石蜡块398对、组织芯片检测，并统计生成了单因素表（TableS1）、多因素表（TableS2）及预后生存曲线图；细胞水平有正反回复、直接机制；动物水平包括靶基因过表达、沉默的功能表型验证，也有标志物的检测；分子水平包括蛋白-蛋白直接机制。因此，对于基金不够充足、平台不够强大的同学，功能基因无疑是一款不错的选择，做好了也可以发高分文章。好了，这篇文献就分享到这里，期待大家都能收获好的结果。点下“在看”，多根头发
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