Nature｜自闭症小鼠模型中催产素应答与社交行为的恢复

本期iProteome为大家带来的是今年五月份发表在Nature的'Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism'一文，描述自闭模型小鼠中催产素应答对小鼠社交性行为会产生影响的相关研究。

研究背景

有超过100个基因突变具有很高的自闭症致病风险，但每个单独的突变仅占总病例的一小部分，这种异质性使得自闭症治疗方法的发展困难重重。这些具有患病风险的突变基因可以被划分到相关功能的通路中，在涉及突触蛋白、翻译调节和染色质修饰的通路中较为突出。为了尽可能减低基因的复杂性，最近的治疗研究方案聚焦在了可以调节哺乳动物社交行为的神经肽催产素以及血管加压素上。在小鼠中，编码催产素或其受体的基因突变会导致社会识别和社会奖励信号的丧失。

简介

本篇文章报道了一种自闭症相关的突触粘附因子Nlgn3的突变，该突变导致小鼠多巴胺神经元的催产素信号受损，改变了小鼠社交能力测试的行为反应，并且Nlgn3的缺失还会破坏中脑腹侧被盖区域的翻译稳态。而利用一种新的、特异性、具有脑屏障穿透性的MAP激酶-相关激酶的抑制剂ETC-168治疗Nlgn3敲除小鼠可以恢复mRNA的翻译以及催产素信号反应。

研究确立了自闭症风险因子Nlgn3、翻译调节和催产素能信号之间存在着的联系，通过对核心细胞功能/过程的研究为减少自闭症异质性提供了务实可行的方案。这一研究结果还可以应用于临床，依据病人的患病机制进行分类，提高药物靶向治疗的成功率。

实验思路

研究结果

在社交适应/识别任务中，幼年Nlgn3KO小鼠的社交趋新性较野生型小鼠显著降低（Fig. 1a-c）。以往的研究表示，对陌生同类的识别和反应依赖多条神经回路，其中包括腹侧被盖区域的多巴胺能细胞（即VTA DA神经元）。因此，研究人员利用Cre-loxP系统选择性地在多巴胺能细胞中重新表达Nlgn3，发现幼年Nlgn3KO小鼠的社交趋新反应恢复至正常状态（Fig. 1d-f）；同时，仅选择性抑制VTA DA神经元中的Nlgn3活性足以影响小鼠的社交趋新性（Fig. 1g-i）。另一实验表明，利用催产素拮抗剂处理的野生型小鼠认知能力受到损伤（Fig. 1j-l），可以认为该检测中的社交认知能力依赖于催产素受体。而VTA DA神经元在社交趋新反应中的功能部分依赖于催产素引起的神经元放电的增加。因此，作者在后续实验中进一步研究了Nlgn3失活是否会影响此类神经元对催产素的响应。

由于下丘脑核轴突释放的催产素增加了投射到伏隔核（NAC）的VTA DA神经元的放电能力，研究人员标记了投射到NAC的VTA DA神经元，并对VTA切片中的神经元进行了电生理记录（Fig. 1m, n）。与野生型小鼠相比，Nlgn3KO小鼠VTA DA神经元的基线放电频率略有降低；值得注意的是，1μM催产素显著增加了野生型小鼠细胞的放电频率，但对Nlgn3KO小鼠的切片没有影响（Fig. 1o-q）。上述实验揭示了VTA对催产素的响应需要Nlgn3的存在。

Fig.1 | 缺乏Nlgn3的VTA DA神经元中催产素的应答改变

在其他自闭症风险因子（Cntnap2和Shank3b）敲除的小鼠体内已报道过催产素能神经元的丢失，但Nlgn3KO小鼠中却没有观察到类似的催产素能神经元密度的变化（Fig. 2a, b）。然而，荧光原位杂交（FISH）结果显示，与野生型小鼠相比，Nlgn3KO小鼠VTA DA神经元的Oxtr mRNA略有增加（Fig. 2c, d）。再对Nlgn3KO小鼠VTA进行shotgun蛋白质组学检测，通过GO和蛋白互作网络功能分析鉴定出分子变化主要集中在蛋白质转运、细胞粘附和mRNA翻译过程中（Extended Data Fig. 4b-d）。已有研究证实，mRNA翻译失调与神经元可塑性缺陷存在联系，且Nlgn3KO小鼠的VTA DA神经元可塑性可被行为诱导改变。因此，作者利用甲硫氨酸类似物AHA插入实验比较了naive和behaviourally exposed的野生型小鼠和Nlgn3KO小鼠中VTA DA神经元的翻译能力：与野生型相比，naive Nlgn3KO小鼠中甲硫氨酸类似物AHA的结合减少了；但是在接受处理的Nlgn3KO小鼠的VTA DA神经元中，AHA的结合增加了（Fig. 2e-g）。实验结果表明，突变小鼠中翻译稳态的紊乱有赖于相关信号的激活。

Fig2 | Nlgn3^KO小鼠VTA中翻译调节的破坏

Extended Data Fig. 4 | Nlgn3小鼠中的核糖体蛋白和翻译过程被改变

翻译稳态的紊乱被认为会通过影响众多神经元蛋白表达而损害神经元可塑性以及神经发育状态。因此，作者试图使Nlgn3KO小鼠的翻译恢复正常，并检测这是否会恢复VTA DA神经元的催产素应答反应。

MAP激酶相互作用激酶（MNKs）是mRNA翻译的关键调节因子（Fig. 3a）。研究人员重点研究了MNK的有效抑制剂ETC-168：在小鼠皮层神经元in vitro实验中，ETC-168能够在不影响eIF4E、eIF4G和ERK1/2蛋白水平的情况下，降低eIF4E的磷酸化水平；WT小鼠in vivo实验结果与其一致，并且药物动力学实验表明口服ETC-168具有显著的脑穿透性（Fig. 3b-d）。随后，研究人员又通过Fmr1KO小鼠的行为学实验证实了ETC-168治疗在改变行为表型方面的有效性。上述实验表明，ETC-168是一种具有高度选择性和脑穿透性的、可改变小鼠的认知行为的MNK1/2抑制剂。

值得注意的是，在Nlgn3KO小鼠的VTA中，eIF4E或MNK1的磷酸化水平和蛋白质水平皆没有发生改变。因此，作者下一个想要弄明白的问题是ETC-168治疗是否会改变Nlgn3KO小鼠VTA的翻译机制。

通过TMT蛋白质定量检测和GSEA富集分析显示Nlgn3KO小鼠VTA中细胞质核糖体核心蛋白增加，但线粒体的不增加（Fig. 3e）；用ETC-168抑制MNK可消除Nlgn3KO VTA核心核糖体蛋白的增加（Fig. 3f）。与vehicle处理的Nlgn3KO小鼠相比，用ETC-168处理过的Nlgn3KO小鼠组织切片中，AHA的结合显著减少，与vehicle处理的野生型小鼠切片AHA结合水平相近（Fig. 3g–i）。

Fig3 | MNK抑制剂ETC-168可恢复Nlgn3^KO 小鼠VTA中的翻译功能

在此之后， 研究人员测试了ETC-168治疗是否恢复了Nlgn3KO小鼠的催产素反应和社交趋新反应（Fig. 4a）。，Nlgn3KO小鼠短期口服ETC-168能够使催产素诱导的放电频率增强至与野生型相同水平（Fig. 4b, c），恢复社交趋新能力，并且该药物对野生型小鼠的社交行为无影响（Fig. 4d–f）。值得注意的是，ETC-168的耐受性良好，在长期治疗中仍然有效（Extended Data Fig. 10）。因此，MNK抑制剂ETC-168可作为治疗药物用于改善Nlgn3KO小鼠的翻译稳态，进而恢复其催产素响应及社交趋新反应。

Fig4| MNK抑制使Nlgn3^KO小鼠恢复了社交趋新反应

Extended Data Fig. 10 | 长期ETC-168治疗影响

总结与展望

综上所述，本文作者从Nlgn3^KO小鼠模型入手，探究治疗自闭症的可行方法。通过基因编辑、电生理实验、行为学实验和免疫荧光标记等方法验证了小鼠VTA DA细胞元中Nlgn3响应催产素信号，增加神经元放电，从而进行社交趋新行为这一机理；利用蛋白质组学的方法找出了Nlgn3缺失通过扰乱翻译稳态的方式损伤催产素应答和影响社交行为；并且找到了可以使Nlgn3^KO小鼠恢复正常生理反应和社交能力的MNK抑制剂——ETC-168，本研究不仅突出了该药物的高度特异性以及脑屏障穿透能力，也拓宽了该抑制剂的应用疾病范围。

作者还认为文章中展示的利用药物抑制MNKs的治疗思路，可能在今后为此类神经发育条件下翻译稳态失调的病例提供一种新的治疗策略。

此外，在两种截然不同的基因模型中出现了相似的翻译机制和表型的紊乱现象，暗示着自闭症的遗传异质性或许能够：归类于数量较少的细胞核心过程中，那么针对这些核心过程的药理学干预可能为更多的患者带来治疗的可行性。

作者：许梓妍

原文引用：doi:10.1038/s41586-020-2563-7