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【研究目的】了解介导动脉内皮细胞分化为IACs的分子机制 【研究策略】scRNA+scATAC
 摘要 骨髓中的造血干祖细胞(HSPC)来源于哺乳动物胚胎主要动脉中的一小部分造血内皮细胞(HE细胞)。HE细胞经历内皮细胞到造血细胞的转变(EHT)，产生HSPC，在定植于胎肝之前累积在动脉内簇(IAC)。为了检测内皮细胞(E)、HE细胞和IAC细胞之间的细胞和分子转变，以及IAC细胞内HSPC的异质性，我们用单细胞RNA测序(scRNA-Seq)和单细胞转座酶可及染色质测序的 (scATAC-Seq)方法，分析了从胚胎9.5天(E9.5) 到E11.5小鼠胚胎的尾动脉（背主动脉(DA)，脐动脉(U)，卵黄(V) ）的大约37,000个细胞，鉴定了从E到HE再到IAC细胞的连续发育轨迹。 1.单细胞分析确定了从内皮细胞到造血干细胞前体的轨迹，并有明确的中期阶段。 2.动脉中的血源性内皮细胞产生两波CD45+细胞：先是祖细胞，然后是造血干细胞前体。 准备B6C3F1/J 3周龄雌性小鼠。雌性小鼠注射5IU孕马血清促性腺激素，48h后注射5IU人绒毛膜促性腺激素，然后立即与C57BL6/J雄性小鼠配对过夜。RUNX1：GFP(Runx1tm4Dow)纯合子雄性小鼠与超数排卵的B6C3F1/J 3周龄雌性小鼠交配产生胚胎，纯化E细胞和HE细胞。雌性B6C3F1/J小鼠与雄性B6129SF1/J小鼠交配分离胎肝HSCs。早晨交配后被认为是胚胎(E)0.5天。
图1 实验设计 1、scRNA-Seq揭示了从内皮细胞到IAC细胞的连续轨迹 我们证实只有HE细胞才能在体外产生造血细胞。在过滤掉非内皮细胞和非造血细胞和减少批量效应后，合并数据集的UMAP显示了从E到IAC细胞的连续轨迹(图2C，D)。UMAP中的两个Efbn2+E细胞流汇合形成一个茎，通向HE和IAC(图2E)。证明不同发育阶段细胞分布的E+HE+IAC样本显示，在E9.5时IAC细胞仅占E+HE+IAC群体的0.5%，但在E10.5时IAC细胞的比例扩大了7倍，占群体的3.5%。这与组织学分析的结果是一致的，显示IAC细胞的数量在这两个胚胎阶段之间是增加的 (图2D，G)。
图2 scRNA-Seq结果 无监督聚类在组合数据集中识别了7个不同的群体，并将两个E细胞流分离成不同的簇。Wnthi E和Wntlo E可进一步细分为动脉E(AE)和静脉E(VE) (图3A-D)。AE集合中转录本的融合是由Wnthi/Lo AE特异性基因表达的丢失和后期特异性基因转录本水平的增加推动的(图3D，E)。在AE集合中激活了其他通路，包括调节细胞形状和运动的通路(“弹性蛋白纤维形成”、“血小板与暴露的胶原黏附”、“缝隙连接组装”)和造血细胞中重要的进程(“整合素MAPK的信号”)(图3F)。
2、RUNX1通过pre-HE和HE之间的发育瓶颈调节进展 AE集合产生了HE和IAC细胞，其特征是高表达的RUNX1和GFI1 (图4A，B)。E10.5 E+HE+IAC的UMAP和拟时序分析显示pre-HE细胞积累，表明pre-HE和HE之间存在瓶颈(图4C)。我们利用Velcyto和scVelo通过模拟基因上调或下调时，结果显示pre-HE细胞的RNA速度明显减慢，表明分化障碍限制了它们向HE的发展(图4C)，然而，一旦pre-HE细胞过渡到HE，它们就会顺利分化为IAC细胞 (图4D)。一旦细胞向HE转化，RUNX1起主导作用。RUNX1在大约7%的pre-HE细胞中表达量上调，表明RUNX1通过瓶颈调节通路(图4B)。 我们用scRNA-Seq比较了AE、Pre-HE、HE和IAC集合在RUNX1+/-和RUNX1+/+同窝小鼠中的细胞分布。与RUNX1+/+胚胎相比，E10.5 RUNX1+/-中HE和IAC细胞的比例降低了68%，pre-HE中的比例相应增加了56% (图4E)。还发现HE细胞比例的增加和pre-HE细胞的比例下降(图4F)，证实了RUNX1通过瓶颈调节了成为HE的pre-HE细胞的数量。这些数据共同证实，RUNX1通过瓶颈调节成为HE细胞的pre-HE细胞的数量。
图4 pre-HE细胞和HE细胞之间的发育瓶颈 3、scATAC-Seq识别RUNX1增强子和转录因子motif增加pre-HE的可及性 我们对E10.5 CD44+E+HE+IAC细胞进行了scRNA-Seq和scATAC-Seq，获得了1670个细胞的高质量开放染色质图谱，涵盖了从E到IAC的各种细胞类型 (图5A)。对特异转录因子(TF)的结合模式进行评估(图5E)，结果显示与TF表达模式有很强的相关性，这与scRNASeq数据的通路分析结果一致。例如，在Wnthi E中检测到强烈的TCF/LEF结合活性，但在AE集合中突然下降(图5E，F)。大部分TF的结合位点的可及性是从pre-HE阶段开始增加，包括HES1、GATA、SMAD和调节HSC体内平衡的TF，如Mecom、Egr1和YY1，后者表明HSC特异的转录程序可能在pre-HE阶段启动。
图5 scRNA-Seq和scATAC-Seq的联合分析 RUNX1含有两个启动子，一个是上游的P1启动子，首先被用于HSPCs，另一个是更接近的P2启动子，在HE和HSPCs中是活跃的。P1首先在IAC细胞中呈现可及性，而P2在包括pre-HE在内的所有内皮细胞中呈现可及性(图6A)，预测的E-Ps的显著性图显示了几个染色质开放与RUNX1表达显著相关的增强子，包括RUNX1+23增强子(图6B)。 候选-371增强子包含GATA、STAT和JUN的motif，表明GATA2和细胞因子和/或炎症信号可能有助于促进该增强子在pre-HE的开放性 (图6A)。基于scRNA-Seq数据的共表达分析表明，这些因子形成了一个位于RUNX1表达之前并与其相关的共表达基因模块(图6E)，表明它们可能协同调节RUNX1的表达。
图6 Runx1上发育阶段特异性增强子分析 4、在IACs中形成了两波HSPCs 主成分分析(PCA)描述了HE分化为IAC细胞时急剧U型转变，反映了AE基因表达的显著减少和造血基因的激活(图7A)。染色质重塑蛋白Nupr1在U型拐点时瞬时表达，而Hey1和Sox17的转录本随着IAC细胞的成熟而显著减少(图7B)。 我们比较了E10.5 CD45+IAC细胞和E11.5 CD45+CD27+CD144+IAC细胞(E11.5 pre-HSCs)，以确定它们之间的发育关系。这两个群体在PCA图的第三主成分中分为两支，大多数E10.5CD45+IAC细胞占据PC3轴的一端，而E11.5 pre-HSCs位于另一端(图7C，D)。约2%的E10.5 IAC细胞被发现在分子水平上类似于E11.5 II型pre-HSCs；在E11.5 IAC细胞中，这一比例增加到67%(图7D)， 与E10.5CD45+IAC细胞相比，在E11.5pre-HSCs中高表达的974个基因包括pre-HSCs和/或HSCs的已知标记基因(Eya2，Procr，Cd27和Mecom)，而在E10.5 CD45+IAC细胞中上调的877个基因包括增殖相关基因(Myc)和淋巴髓系相关基因(Il7r，Fcer1g)(图7E，F)。通路分析表明E11.5 pre-HSCs获得了干细胞特异性特征，，而与E10.5CD45+IAC细胞相关的通路与细胞周期有关和/或与特定的造血谱系有关 (图7G)。 E10.5CD45+IAC细胞含有巨噬细胞和粒细胞/单核细胞的祖细胞，但与E9.5YS-EMPs相比，红系或巨核系祖细胞很少(图7H)。E10.5CD45-IAC细胞也含有具有淋巴系和髓系潜能的祖细胞，尽管其频率低于E10.5CD45+IAC群体。综上所述，E10.5CD45+IAC细胞表明了在E11.5 II型pre-HSCs出现之前的IACs中具有明显淋巴-髓系偏向的祖细胞。
图7 IAC细胞中两波CD45+ HSPCs的分析 我们的scRNA-Seq分析表明，RUNX1减少造成的缺陷至少部分是由于pre-HE向HE细胞的低效转变造成的。在HE之前，RUNX1在一部分内皮细胞中低水平表达，这与P2启动子和几个RUNX1增强子在内皮细胞中染色质的可及性一致。RUNX1在内皮细胞中的表达似乎是随机的；然后它在部分pre-HE细胞中增加，并在HE和IACs中均匀高表达。 scATAC-Seq显示RUNX1(-371)中的一个远端增强子，在pre-HE首先变得具有可及性。-371增强子中高度保守的TFmotif包括GATA、STAT和JUN，这意味着与这些motif结合的TF可能在pre-HE中打开增强子的过程中发挥作用。 IACs至少包含两种不同的HSPC亚型，即致力于淋巴髓系偏向的祖细胞和pre-HSCs。细胞命运概率分析表明，E10.5HE比E9.5HE更有可能承担pre-HSC的命运，这与E11.5 IACs比E10.5 IACs含有更多的pre-HSC的观察结果是一致的。 单细胞系列链接 |
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