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 摘要透明细胞肾癌 (ccRCC) 是肾细胞癌最常见和最具侵袭性的组织学亚型。超过三分之一的 ccRCC 患者在手术后复发并发生转移。转移性 ccRCC 患者的预后较差，5 年生存率为 10%。 本文对 ccRCC 原发性肿瘤组织进行了 scRNA-seq 和 scATAC-seq，描绘了ccRCC的肿瘤微环境转录组和表观组图谱，确定了介导肿瘤细胞特异性调节机制且与免疫细胞功能状态相关的关键转录因子。 ccRCC 中的单细胞转录组和染色质可及性分析作者对4名ccRCC患者肿瘤组织的scRNA-seq数据和其中3名患者的scATAC-seq数据进行了分析，scRNA-seq注释得到15种细胞类型，scATAC-seq得到12种细胞类型。 确定了5类主要的淋巴细胞群：CD4+ 和CD8+ T细胞、Treg、NK/NKT细胞、B细胞；三类髓系细胞群：巨噬细胞、单核细胞和肥大细胞；以及两类非免疫细胞：内皮细胞和间质细胞。肿瘤细胞是根据CA9表达量和拷贝数变异（染色体 3p 缺失或染色体 5q 增加）来确定的。 发现免疫细胞在ccRCC肿瘤微环境中占比最高，超过70%，而肿瘤细胞占比不足10%。  ccRCC 中的肿瘤特异性调控元件作者为了研究不同细胞类型的染色质可及性的差异，使用MACS2在scATAC-seq数据中发现了212,326个峰，其中的10.6%在不同细胞类型之间具有显著差异，这些峰被定义为差异可及染色质区域（DARs）。其中内皮细胞和间质细胞的DARs最多，肿瘤细胞次之，大部分DARs位于基因组的启动子和内含子区域。肿瘤细胞的DARs显著富集于代谢相关通路。 然后使用chromVAR分析转录因子在不同细胞类型中的活性程度。发现EOMES和TBX5富集在NK/NKT和CD8+ T细胞中，SPI1富集在巨噬细胞中，CEBP在单核细胞中，GATA2在肥大细胞中。同时，作者发现两个内皮细胞亚群富集的转录因子差异：SOX在VCAM1-内皮细胞的活性较高，而STAT1和NFATC4在VCAM1+内皮细胞中富集。 之后为了探索与肿瘤生长发育相关的转录因子，作者计算了各个转录因子的chromVAR得分在每个细胞类型的标准差，发现了49个在肿瘤细胞中标准差高于任何其他细胞类型的转录因子。得分最高的肝细胞核因子1（HNF1A，HNF1B）是一个与肾脏发育障碍有关的转录调节因子家族，并且特异性的在肿瘤细胞中高表达。另外，HOX家族的TFs同样在ccRCC的肿瘤细胞中高度富集。生存分析显示，在TCGA-KIRC队列中，高表达这49个肿瘤特异性TF的患者具有更短的总生存期。  之后进一步验证肿瘤特异性TFs在ccRCC中的生物学功能。主要针对4个在TCGA-KIRC中呈现不良预后的TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP）。作者构建转录因子调控网络发现这四个TFs调节多个肿瘤特异性基因，如FXYD2和CRYAB等。敲除这些TFs后，肿瘤细胞的增殖能力明显减弱，细胞死亡情况增多。 作者在LINCS consortium小分子化合物的资料库中找到两种获得FDA批准的显著降低HOXC5、ISL1和VENTX表达水平的药物：homoharringtonine（HHT）和mitotane，实验也证明，这两种药物在两个肾癌细胞系中显著降低了肿瘤细胞的增殖率以及HOXC5、ISL1和VENTX的表达水平。  ccRCC中CD8+ T细胞的特征CD8+ T细胞在抑制肿瘤进展中起着关键作用，于是作者对scRNA-seq和scATAC-seq数据中的CD8+ T细胞进行了进一步的分析。 scRNA-seq继续细分得到4个亚群，scATAC-seq得到5个亚群。利用marker基因（CD69、ZNF683/Hobit、ITGAE/CD103和ITGA1/CD49A），作者在scRNA-seq和scATAC-seq数据中都找到了组织驻留型CD8+ T细胞。此外，还根据PDCD1和TOX42找到了耗竭CD8+ T细胞（exhausted CD8+ T cells）。通过基因HSPA1A、DNAJB1、JUNB和ATF3找到了exhausted immediate-early genes, exhausted IEG。 然后，作者使用VISION分析发现，耗竭CD8+ T细胞亚群在细胞毒性和耗竭方面得分高于其他亚群。根据最近研究，祖耗竭T细胞（progenitor exhausted T cells）比终末耗竭T细胞（terminally exhausted T cells）可以更有效地控制肿瘤，并且对anti-PD-1疗法有更好的响应。作者发现在组织驻留C1亚群涉及的信号通路与祖耗竭T细胞更为相似，表明该亚群在肿瘤免疫治疗中有重要作用。 另外作者对CD8+ T细胞的每个亚群进行了差异分析，发现组织驻留C1亚群与炎症反应明显相关，组织驻留C2亚群则与细胞因子和维生素代谢途径相关。 同时，在scATAC-seq数据中，CD8+ T细胞耗竭相关的EOMES和BATF转录因子在耗竭亚群中高度富集。多个Rel/NF-κB家族的转录因子，如RELA和NFKB1，也在耗竭亚群中富集。  ccRCC中巨噬细胞的特征肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages, TAMs）是肿瘤中髓系细胞的主要亚群，在肿瘤发生发展和肿瘤耐药中发挥着重要作用。作者分别在scRNA-seq和scATAC-seq数据中分别注释出了三个TAM亚群。
于是作者推测TAM-RGCC亚群与M1巨噬细胞的特征最为相似，其次是TAM-C1QB亚群，而TAM-LGALS3的细胞特征则和M2巨噬细胞更相近。TAM-RGCC亚群的特征之一为促血管生成，而TAM-C1QB亚群的特征表现为更强的细胞吞噬作用，说明该亚群具有很高的吞噬活性。 scATAC数据发现四个转录因子（MEF2C、NFKB1、RUNX3和ENO1）在不同的亚群中的基因表达和活性都有大幅增加。调控网络鉴定了MEF2C的靶向基因，发现该基因调节多个转录因子（如FOXO1、NEU1和NRP1）和趋化因子（如CCL3和CCL3L1）。  ccRCC 微环境中的细胞通讯作者使用CellPhoneDB分析了细胞通讯，发现内皮细胞的配体-受体相互作用最为密切，而B细胞最少。肿瘤细胞可以通过多种配体-受体相互作用与内皮细胞、TAMs、增殖型CD8+ T细胞和耗竭型CD8+ T细胞进行交流。 研究表明，各种免疫细胞（尤其是巨噬细胞和T细胞）与肿瘤细胞之间的通讯在肿瘤免疫逃避中发挥重要的作用。于是，作者分别选择髓系和淋巴系中与肿瘤细胞相互作用次数最多的三个亚群进行研究。发现肿瘤细胞和各个TAM亚群之间有很强的相互作用，这种相互作用是由巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）及其受体（CD44和CD74）介导的。此外还发现了一些在ccRCC中没有报道过的相互作用，例如核糖体蛋白S19（ribosomal protein S19, RPS19）和complement C5a receptor 1, C5AR1之间的配体-受体相互作用。在TCGA-KIRC数据集中，RPS19和C5AR1的高表达量与患者预后不佳相关。 另外，肿瘤细胞和三种淋巴细胞亚群（增殖型CD8+ T细胞、Treg和耗竭型CD8+ T细胞）之间也存在多种相互作用。较高的LTB和LTBR的表达量也与较差的临床预后相关。  小结作者利用scRNA-seq和scATAC-seq确定了ccRCC肿瘤细胞中几个参与调控的关键转录因子，然后揭示了转录因子如何控制细胞的功能状态，并且重点关注了两个主要的免疫细胞亚群：CD8+ T细胞和巨噬细胞。此外分析了ccRCC肿瘤微环境中多个细胞类型间的互作，发现了几个重要的受配体，比如RPS19-C5AR1和LTB-LTBR。 |
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