动态 | 张泽民教授课题组再发Cell，用到的单细胞技术了解一下？

4月16日，百奥智汇创始人、科学顾问张泽民教授在北京大学的课题组与合作者在国际顶级学术期刊《Cell》上发表了题为＂Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer＂的文章，利用单细胞转录组测序技术对结直肠癌患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞类群首次进行了系统性的刻画，同时利用小鼠模型，对anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理给出了解释。

该研究建立了结合肿瘤患者及小鼠模型的单细胞转录组来研究肿瘤免疫治疗的范例，为人们研究其他疾病中免疫细胞以及开发新的治疗方案提供了思路。

图1 课题总体设计与免疫治疗作用机制

对于该研究，上海市免疫学研究所苏冰所长、上海交通大学医学院叶幼琼研究员等相关专家点评道：该工作全面地解析结肠癌的肿瘤微环境细胞图谱，阐明细胞与细胞之间的相互作用，对靶向肿瘤免疫微环境为基础的肿瘤治疗提供了更详细的理论基础，为今后靶定髓系细胞的精准治疗提供助力，具有重要的临床转化意义。

在该研究中，研究者共使用了Smart-seq2、10x 3′ Gene Expression、10x V(D)J + 5′ Gene Expression等3种单细胞测序技术，以及tSNE、UMAP、PCA、RNA velocity、URD、PAGA、STARTRAC、GSVA富集分析、热图、小提琴图、气泡热图、轨迹图、Circos图、火山图、生存分析等十多种生物信息学分析及展示方法。

值得一提的是，这些实验技术和分析方法，百奥智汇皆可实现。

下面，百奥小编就为大家详细解析，带大家了解这些技术和方法是如何在研究中应用的。

1.10x Genomics和Smart-seq2技术比较

图2 实验设计流程及两种测序技术的结果比较

该研究首先评估并比较了10x Genomics和Smart-seq2两种单细胞测序技术的结果。结果显示，与10x scRNA-seq平台相比，Smart-seq2捕获了更多的基因，包括细胞因子，CD分子，配体/受体和转录因子，并且显示出较弱的批次效应 ，从而可以对调节途径进行更深入的分析（图2），而10x平台则获得了更多的分群。因此，作者将两种技术同时使用，从而能够最大化地确定细胞类型或稀有种群的数量，改善细胞聚类的结果，得出更准确的结论。

2.tSNE降维——展示分群、基因表达模式、组织分布等多层信息

图3 18位CRC患者的所有免疫细胞和非免疫细胞的簇

该研究使用无监督聚类、PCA、CGA等方法对来自18位CRC患者肿瘤、邻近组织和血液样本的10× 3′ Gene Expression （ 43,817个细胞）和Smart-seq2（10,468）单细胞测序结果进行整合聚类分析，然后用tSNE进行降维展示，分别得到38个和36个群，包括6个内皮细胞群，2个成纤维细胞群，13个髓系细胞群，4个ILC群，18个T细胞群和5个B细胞群等（图3）。

图4 特定免疫球蛋白基因在B细胞群中的不同表达模式

对于淋巴细胞，研究通过特异的的免疫球蛋白重链特征基因加以区分（图4）。

图5 分群结果的组织分布图

同时，研究还在tSNE结果中展示了各细胞的组织分布情况（图5）。

图6 Smart-seq2测序非免疫细胞结果的tSNE分群展示

图7 tSNE展示特定基因在非免疫细胞的表达情况

对于Smart-seq2非免疫细胞的测序结果，该研究利用tSNE将其分为12个亚群，包括4个恶性细胞亚群和8个非恶性细胞亚群（图6）。其中，由推断的拷贝数变异（CNV）定义的恶性细胞表现出高度的基因表达异质性，形成了患者特异性的分群（图7）。

3.热图、气泡热图——展示细胞间基因表达模式的差异

单个tSNE图或组图可展示单个或数个基因在不同细胞群中的表达情况，但在展示多个样本大量基因的全局表达情况时就相对吃力。此时就需要用到热图。而气泡热图则是在热图的基础上加入了基因表达细胞在特定细胞群中占比的信息，从而对细胞群进行更详细的表征。

图8 10x测序得到的髓系细胞和淋巴细胞群的基因表达热图

图9 10x和Smart-seq2测序得到的基因表达热图

在该研究中，作者用热图展示了10x测序分析得到的38个白细胞群中的差异基因表达差异（图8），以及整合10x和Smart-seq2测序分析得到的48个群的基因表达差异（图9）。

图10 气泡热图展示9个髓细胞的特征基因表达

研究还分析了13个髓系细胞中的特征基因表达情况（其中9个以气泡热图展示），并据此将它们区分为肥大细胞（hM01），树突状细胞(hM02-04)，单核细胞(hM05-07，hM11)，组织驻留性巨噬细胞（hM08-10）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs，hM12-13）。

4.扩散图、RNA velocity、URD、PAGA——推断和展示细胞发育轨迹

图11 结合RNA velocity的扩散图展示单核细胞的发育轨迹

为进一步探索TAMs的来源，该研究利用扩散图中嵌入的RNA velocity对随机选择的单核细胞和巨噬细胞的发育轨迹进行推断和展示，鉴定出了从表达CD14的单核细胞向FCN1+ 单核样细胞和不同的巨噬细胞群体的强烈定向流动（图11），体现二者在发育上的前后顺序。

图12 基于URD的单核细胞拟时发育轨迹图

图13 巨噬细胞的发育轨迹图

进一步利用URD和PAGA这两种正交算法分析巨噬细胞的转录轨迹，发现巨噬细胞发育成TAMs（图12，图13）。

图14 多种组织中单核细胞/巨噬细胞谱系的发育轨迹模型

综合上述轨迹推断结果，研究发现TAM主要来自独特的肿瘤浸润性单核样细胞前体。其中， C1QC+ 和 SPP1+ TAM都从浸润肿瘤的单核细胞样前体形成，而 SPP1+ TAM也可能源自 NLRP3+ RTM（图14）。

5.火山图、富集分析、热图、URD图——多角度展示两类TAMs差异

对于两类在发育轨迹上存在显著差异的TAMs，作者进一步使用热图、火山图、富集分析等方法进行了分析，从多角度揭示了它们的差异。

图15 热图展示两类TAMs转录因子表达差异

由于细胞的发育轨迹受转录调控网络控制，作者先分析了两类TAMs转录因子的表达差异，结果以热图显示。其中，C1QC+ TAMs显示出MAF/MAFB和FOS/JUNS高表达，而PP1+ TAMs则高表达CEBPB和ZEB2。

图16 火山图展示两类TAMs表达差异

然后，作者又用火山图展示两类TAMs中显著差异表达的基因。该图包含两个维度，其中纵轴P value体现显著性，横轴fold change展示差异性。

结果显示，C1QC+ TAMs显示出补体C1Q、TREM2、MERTK和CD80等基因的高表达， 而SPP1+ TAMs显示出SPP1、MARCO和VEGFA的特异性表达。

图17 GSVE分析展示两类TAMs在通路上的差异

随后，作者又使用基因集合变异分析（GSVE）分析了两类TAMs在通路上的差异。GSVE是一种以非监督方式对一个群体评估通路活性差异的基因集富集（GSE）分析方法。

该研究的结果显示，SPP1+ TAMs显示出肿瘤血管生成，ECM受体相互作用、肿瘤脉管系统、大肠腺瘤和转移性肝癌等通路的特异性富集，而C1QC+ TAMs则显示出补体激活以及抗原加工和呈递途径的富集（图17）。

图18  URD图展示TAMS血管生成和吞噬作用相关基因的表达

此外，SPP1 + TAMs还显示了大肠腺瘤和转移性肝癌通路的特异性富集和相关基因的表达（图17和图18），表明在它们CRC中有促癌/促转移作用。

6.相互作用网络图和Circos图——展示细胞间相互作用、受体配体相互作用

图19  基于单细胞测序和GTEx数据的细胞间相互作用网络图

图20 基于单细胞测序和TCGA数据的细胞间相互作用网络图

更进一步地，作者在CRC中建立了细胞间相互作用网络图。将该研究中的单细胞测序数据集与GTEx、TCGA的组织整体RNA测序数据集进行整合分析，发现TAM和cDC作为预测网络的核心，与其他细胞类型的联系最多（图19，图20）。其中，C1QC+ TAM和两组cDC主要与其他免疫细胞（尤其是T细胞亚群）相互作用（图20），提示其在抗肿瘤T细胞应答中起调节作用。

图20  Circos图展示细胞群间的受体——配体相互作用

再进一步的细胞群间的受体——配体相互作用分析显示，在与髓系细胞和T细胞有关的配体-受体对中，CXCL10-CXCR3在C1QC + TAM中富集，暗示了C1QC+ TAM具有募集或激活T细胞的潜在作用。而SPP1+ TAMs中富集的SPP1-ITGAV、SDC2-MMP2、FN1-ITGA5等配体-受体对，则暗示了其在可能与某些整合蛋白相互作用，以促进CRC的肿瘤发生。

7.相似性分析、热图——展示跨物种的细胞群相似性

图21  将两种对免疫治疗敏感的小鼠模型用于单细胞测序分析

图22  相似性热图显示出小鼠髓系细胞群与人的相似性

为了将上述对人髓系细胞异质性的研究发现与临床应用相结合，作者接下来将相同的实验和分析方法用于两种对肿瘤免疫治疗的小鼠模型中，其中Renca对CSF1R阻断抗体敏感，而MC38对CD40激动剂抗体敏感（图21）。

作者使用10x Genomics平台对免疫治疗后小鼠的肿瘤中分离出的免疫细胞进行了单细胞转录组测序，并与人髓系细胞群进行了相似性分析，确定了多个跨物种相对应的髓系种群，包括两种cDC群和两种TAM群（图22）。

图23 热图显示小鼠TAM的GSVA分析结果

此外，对小鼠TAM群进行与人类TAM群相同的途径分析发现，小鼠TAM群体也基于它们的血管生成，低氧和T细胞相互作用基因特征而分离（图23）。这些数据表明人类CRC患者和小鼠肿瘤模型之间存在功能相似的TAM群体。

8.细胞丰度、生存分析——体现不同细胞类群的抗药性

图24 抗CSF1R治疗对不同小鼠TAM群体的影响

图25 柱状图显示抗CSF1R治疗后小鼠各类亚群的丰度

进一步的耐药性研究显示，抗CSF1R治疗后F4/80高表达的巨噬细胞优先减少（图24），说明不同的巨噬细胞群体对抗CSF1R治疗的敏感性不同。同时，治疗后小鼠细胞群中mC12和mM14簇几乎完全丢失，TAM簇mM11，mM13和mM15的减少最小（图24），说明TAMs对CSF1R阻断的治疗具有抗性。同时，抗CSF1R的TAM亚群优先表达参与血管生成和免疫抑制的基因，如Vegfa，Cd274和Arg1。

图26 生存分析图显示不同TAMs基因特征CRC患者的预后情况

为了将在小鼠中的发现与人类CRC相关联，作者使用生存分析比较了具有不同水平C1QC+ TAM和SPP1+ TAM基因特征患者的生存率，发现低C1QC+ TAM、高SPP1 +TAM组合与CRC患者的预后更差相关（图26）。

这些发现表明，抗CSF1R治疗可能不足以耗尽所有具有促进肿瘤生长潜力的巨噬细胞，这一特性可能是其单药疗效差的原因。

图27 生存分析图显示不同DC激活程度CRC患者的预后情况

类似的分析应用于抗CD40治疗则发现，抗CD40治疗能够激活cDC1细胞，CCL22等激活的基因特征与CRC患者的总体生存期呈正相关（图27），这可能部分解释了抗CD40激动剂治疗CRC的机制。

9.STARTRAC——分析T细胞的迁移、克隆扩增和发育转变

众所周知，T细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。为进一步探索抗CD40激动剂治疗CRC的机制，作者基于TCRα和β链序列，应用STARTRAC算法分析抗CD40治疗后T细胞的迁移、克隆扩增和发育转变，以了解抗CD40激动剂治疗对肿瘤浸润性T细胞功能的影响。

图28 抗CD40激动剂治疗对T细胞迁移的影响

图29 抗CD40激动剂治疗对T细胞克隆扩增的影响

结果显示，抗CD40激动剂治疗后，Ccl5+ Tem CD8+ T细胞具有比其他CD8+ T细胞亚群更高的迁移指数（图28）。进一步剖析Ccl5+ Tem亚群内的TCR克隆型表明，克隆扩增较高的细胞在肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间表现出更多的TCR共享，表明这些细胞在抗CD40处理后具有更强的迁移能力（图29）。

图30 抗CD40激动剂治疗对T细胞发育转变的影响

同时，Ccl5+ Tem和Cxcr6+ Trm CD8+ T细胞之间的过渡指数在基线时显着高于CD8+ T细胞亚群中其他对的过渡指数，表明某些Cxcr6+ 肿瘤中的Trm细胞可能在某一过程中由浸润的Ccl5+ Tem细胞发育转变而来，这一过程在抗CD40治疗后得到了进一步增强（图30）。

这些数据表明，抗CD40治疗对肿瘤浸润性T细胞的扩增，迁移和发育转变具有独特影响，能够加强Ccl5+ Tem的迁移和克隆扩增能力，及其向Cxcr6+ Trm CD8+ T细胞转变的能力。

10.相关性分析——揭示细胞间存在相互作用

图31 Th1类细胞与cDC1细胞的相关性分析

在研究中作者发现，Th1类细胞与成熟和未成熟的cDC1细胞均显示正相关，表明这两类细胞之间存在相互作用。在此基础上，结合该研究中发现的Bhlhe40 + Th1类细胞在抗CD40治疗后的占比以及特异性扩增、Bhlhe40 + CD4 + T细胞能够产生更多IFNγ，以及之前研究发现的表达IFNG的BHLHE40 + Th1样细胞富集于MSI CRC患者人群中且显示出对ICB治疗的良好反应等结果，作者认为抗CD40治疗导致增加的Bhlhe40 + Th1样细胞可能为在该模型中CD40激动剂治疗能够成功与抗PD1协同的机制提供了解释。

总的来说，该研究的思路是：

先通过单细胞转录组、免疫组测序等技术，对CRC患者的肿瘤微环境进行细胞分群、基因差异表达、细胞发育轨迹、细胞间相互作用等多水平、多维度的详细表征，发现了肿瘤浸润髓系细胞类群中两类特殊的细胞类群TAM和cDC可能在CRC的抗肿瘤T细胞应答、肿瘤发生等过程起调节作用。然后利用小鼠模型，将上述发现应用于对anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略的潜在作用机理的解释中。