感受态细胞

Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。

大肠杆菌CaCl2感受态细胞的制备 

1．划线接种受体菌（DH5α或DH10B）于平板过夜，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养

过夜（约16小时）；

2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时

（250-300 rpm）至OD约0.5；

3．将菌液放在冰水混合物中摇晃冷却10分钟；

4．4℃下2500 g离心5分钟；弃上清，加入100 ml预冷的0.1M CaCl2溶液重新悬浮细胞，在冰

上放置20分钟；

5．4℃下2500 g离心5分钟；去上清，加入100 ml预冷0.1M CaCl2溶液在冰上使细胞重新悬浮；

6．4℃下2500 g离心5分钟；最后一次尽量倒干净， 加入1ml预冷0.1 M CaCl2溶液重悬细胞，

50~100 ul/管分装，液氮速冻后存于-80 ℃ 。

1、所用器具的洁净程度：no detergents

2、培养基的装量：1/10 ~ 1/5培养瓶容积。

3、培养基的pH值：接种前的pH值在6.8-7.2；菌摇好后不低于6.0。 4、培养后的OD值：0.4~0.6

5、培养温度：较低的温度18 ℃ ~22 ℃培养有利于感受态的形成。

6、加入DMSO保存感受态细胞。 7、液氮速冻后保存于超低温冰箱内。

热激转化

1. 取100 ml 感受态细胞，加入2-5 ul 重组DNA连接液，混匀；

2. 冰浴放置半小时；

3. 在42℃保温 90 s；

4. 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟；

5. 加入1 ml 新鲜SOC培养基(不含抗生素)，于37℃ 60 rpm 

培养1小时；

6. 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。

电击转化

将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化

仪的样品杯中，两极施加高压电场。在强大电场的作用

下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分

子便可进入细胞内。

转化效率：

Ca2+诱导转化 10⁶ - 10⁸

/ mg DNA

电穿孔转化 10⁸ - 10¹⁰ / mg DNA

电转感受态细胞的制备

1、 -80℃冰箱保存的菌种在SOB固体平板上划单菌落；

2、次晨，挑选单克隆感至内含1 ml SOB液体培养基的试管中，37℃，300 rpm，6 hr； 3、然后转接到含400 ml SOB液体培养基的2L摇瓶中（按1:500的量转接），300 rpm，

4hr，然后每隔10 min测一次OD600，至OD600=0.55； 4、立刻置冰水浴中骤冷，在冰水混合里旋动内有培养物的三角瓶；

5、随后在250 ml预冷的离心杯中离心，4℃，2000 g，10 min； 6、弃上清后，用预冷的灭菌重蒸水洗，2200 g，10 min，弃上清；

7、用预冷的10%的甘油同样方法再洗两次，2400 g，10 min； 8、最后一次尽量倒干净甘油，用残存在管底的甘油悬浮细胞，冰上分装每100μl到

预冷过的Ep管中，液氮速冻后保存在-80℃冰箱。

每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于

在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，

因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞

接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体

细胞不长）。

单位： CFU（colony forming unit）

例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有

1 08个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3. 4X1011个分子

（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一

个分子进入受体细胞。 1ng pUC18转化100ul感受态细胞，加入900ul培养基复苏1小时后取

10ul涂板，1000 colonies(=1000ng*1000 colonies*1000ul/10ul)=10⁸,

100 colonies=10⁷, 10 colonies=10⁶

转化效率的用途

利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。例如，某一DNA重

组实验的重组率为80%，转化率为107/mg载体，经切接处理后的载体转化率一般要比

天然的载体低100倍。欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？

若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：

^{104/107 X 102 = 0.1 mg 载体DNA}

考虑到实验系统的重组率为80%，所以实际投入载体应为：

0.1 / 80% = 0.125 mg 载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按比例算出，还可以估算涂布量。

转化率的影响因素

载体本身的性质：

不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。

载体的空间构象：

质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于

空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低

两个数量级。

插入片段的大小：

对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。

商品化感受态细胞

超级感受态细胞：Stratagene提供多种>5 x 109 转化子/μg 超螺旋

DNA转化效率的化学法超级感受态细胞，适合克隆获得大质粒、连接

DNA克隆和建库时使用。

电转化感受态细胞：Stratagene的电转化感受态细胞耐受电击处理，

在DNA材料极珍贵、量少时、或构建有代表性文库时，可以采用电转

化感受态细胞.ElectroTen-Blue细胞，是目前商品化的电转化感受态

细胞中效率最高的，达到>3 x 1010 转化子/μg 超螺旋DNA。