shRNA实验步骤

试剂

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实验步骤

1.合成Nestin干扰序列

2.干扰序列退火

将正反向干扰序列以10μM浓度溶于ddH2O，按以下体系将正反向干扰序列退火形成双链粘末端DNA：
10 μL Forward oligo
10 μL Reverse oligo
5 μL 10x NEB buffer 2
25 μL ddH2O
置于100度水，自然降温

3.将Nestin干扰序列克隆至PLKO.1载体质粒

3.1 PLKO.1载体质粒酶切

AgeI HF+ EcoRI HF酶切pLKO.1载体质粒，体系如下：

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37°C孵育1.5h。(酶切时间可延长到＞2h)

琼脂糖凝胶电泳，可见1kb和7kb两个条带，切胶回收7kb条带（靠凹槽的那条）。
Run digested DNA on 0.8% low melting point agarose gel until you can distinctly see 2 bands, one 7kb and one 1.9kb. Cut out the 7kb band and place in a sterile microcentrifuge tube.
1、配制成1%琼脂糖胶（0.5小时）0.7g+70ml 1TAE溶液（浓度越大，区分度越小），加10000的核酸染剂（amino acid stain）7µl。
2、电泳槽中，黑色为负电极，红色为正电极，凹槽对着负极。大凹槽可加50µl，小凹槽可加10µl。
3、吸取5µl DL5000 DNA marker加入电泳槽。
4、吸取5µl 10*DNA loading buffer加入PLKO酶切液中。
5、参数设定100V，20min左右（条带跑到胶中间比较合适）。
6、暴光200ms以上，观看条带。
When visualizing DNA fragments to be used for ligation, use only long-wavelength UV light. Short wavelength UV light will increase the chance of damaging the DNA.
7、剪下条带，称重。专用试剂盒，用1：1溶解液溶解（即若条带重220ug，则用220ul溶解液）。60ul洗涤液洗2次，离心，去除下清液，甩干，加25ul DDH2O溶解，收集下清液。
8、测量双酶切载体质粒浓度

3.2 连接

体系如下：

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(If you were unable to measure the DNA concentration, use 1 μL)
双酶切载体质粒要测浓度，再算体积。
16°C孵育4-20h。

3.3 转化

从-80℃冰箱取出DH5α感受态菌100ul（一般用20ul即可），立即放冰上缓慢溶解10min。
把2μL连接产物加入到感受态细胞中，放置冰上孵育30min。
于42℃热激细胞30s~60s。
热激完成后，立即将细胞转移到冰上孵育2min。
加入250μL S.O.C. medium，然后在37℃、225 RPM的摇床里孵育1h。离心，即其中100ul，吹打细胞溶解。
把100μL转化物涂板至100（50) μg/mL Amp的LB平板上，37℃孵育过夜。（倒置培养，即字在上面）
挑选出单菌落，选出重组子进行双酶切检测和测序。(挑出单菌落到LB + 100 μg/mL ampicillin的15ml离心管中，取1ml送测序)

4.慢病毒包装与转染

4.1慢病毒包装方法：

a. 将293T细胞接种在10cm皿中，待其90%满的时候换新鲜不含双抗的293T培养液（DMEM+10%FBS)。
b.混合慢病毒载体质粒,目的质粒
In polypropylene microfuge tubes (do NOT use polystyrene tubes), make a cocktail for each transfection:
1 μg pLKO.1 shRNA plasmid
750 ng psPAX2 packaging plasmid
250 ng pMD2.G envelope plasmid
to 20 μl serum-free OPTI-MEM
c.(最好在下午或者晚上做)步骤a 2h后将慢病毒载体质粒，目的质粒混合加入无血清的OPTI-MEM培养基中（先加培养基，再加Lipo-fectamine 3000，最后加质粒。Lipo-fectamine 3000与质粒1：1加入，如2ul: 2ug。质粒需经验性计算用量）Lipo-fectamine3000说明书推荐2种用量，可参考。
（静置5min后加入X-treme HP，非常规），颠倒混匀后静置15min，加入293T细胞中。
d. 12-16h左右换液( fresh DMEM + 10% FBS + penicillin/streptomycin)，继续培养24h-48h左右，收集含有病毒的上清培养液(polypropylene storage tube),Spin media at 1,250 rpm for 5 minutes to pellet any HEK-293T cells that were inadvertently collected during harvesting.储存于4℃冰箱
e. 慢病毒超速离心浓缩，弃上清，溶于1×PBS后，分装保存于-80℃。（可以不离心，直接用上清培养液加入，一般是1ml培养液加1ml培养基）

4.2Determining the Optimal Puromycin Concentration：

Each cell line responds differently to puromycin selection. Addgene strongly recommends that you determine the optimal puromycin concentration for your cell line before initiating your experiment.
Day 1: a. Plate target cells in ten 6 cm plates and grow at 37° C, 5% CO2 overnight.
Day 2: b. The target cells should be approximately 80-90% confluent.
c. Dilute puromycin in the preferred culture media for your target cells. The final concentration of puromycin should be from 1-10 μg/mL in 1 μg/mL increments. d. Label plates from 1-10 and add appropriate puromycin-containing media to cells.
Days 3+: e. Examine cells each day and change to fresh puromycin-containing media every other day.
f. The minimum concentration of puromycin that results in complete cell death after 3-5 days is the concentration that should be used for selection in your experiments. (You may wish to repeat this titration with finer increments of puromycin to determine a more precise optimal puromycin concentration.)

4.3慢病毒转染方法：

准备六孔板一个孔细胞，吸去细胞培养液，加入混匀了的病毒转染液（950μL培养基+50μL浓缩病毒+1μL 1000×Polybrene），37℃，5% CO2培养箱中培养。12h后，更换回普通培养基。使用Puro（PLKO.1载体）或zeocin（pENTR223.1载体）筛选3~5天，纯化转染成功细胞株。PLL3.7载体转染后，通过流式细胞仪分选GFP+细胞，纯化转染细胞株。

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