【原】昆虫表达体系蛋白表达和纯化

昆虫表达体系是四大蛋白表达系统（原核细胞，酵母，昆虫细胞，真核哺乳动物表达体系）之一。昆虫表达系统的原理是通过将转移载体中的表达组件转座到大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清侵染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。

昆虫表达体系有很多优点：
1、具有糖基化，乙酰化，磷酸化作用等蛋白翻译加工修饰；
2、易于操作。杆状病毒基因组较小，分子生物学特性简单；
3、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养；
4、可表达较大的外源性基因而不影响本身增殖；
5、可以高效表达外源基因。

今天小优为大家介绍一篇中国农业科学院蜜蜂研究所近期发表的文章：蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

实验步骤：
1、引物设计与合成
根据GenBank中已登陆的意大利蜜蜂MRJP2基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计MRJP2基因全长引物序列。

2、MRJP2基因扩增和克隆
从意大利蜜蜂头部提取总RNA，以提取的RNA为模板，使用RT-PCR试剂盒进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增MRJP2基因。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收DNA。
将回收的DNA与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。挑选单克隆菌落，菌落PCR鉴定，并进行测序。

3、MRJP2-Bacmid重组杆状病毒质粒构建
利用限制性内切酶Not I和Hind III分别对pFastBac1载体和MRJP2质粒双酶切，酶切后的质粒和载体经琼脂糖凝胶电泳分离，回收纯化。MRJP2质粒和pFastBac1载体连接。取5ul连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。挑选单克隆菌落，菌落PCR鉴定，并进行测序。

将测序正确的pFastBac1-MRJP2质粒转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，37℃，220 r/min培养4h。复苏完成后，用SOC培养基将转化液进行10,100和1000倍梯度稀释，每个稀释梯度取100ul铺LB平板（50ug/ml卡那霉素，7ug/ml庆大霉素，7ug/ml四环素，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。将平板倒置37℃恒温培养箱培养48h，挑取白色单菌落，重新划线LB平板培养基，37℃过夜。

挑选白色单菌落，转接到LB培养液中（50ug/ml卡那霉素，7ug/ml庆大霉素，7ug/ml四环素），37℃，220r/min培养过夜。用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒提取MRJP2-Bacmid质粒，以该质粒为模板，利用通用测序引物M13-F/M13-R进行PCR鉴定。构建成功的质粒PCR产物为3680bp。（图1）
 
4、重组蛋白的表达
用培养基在27℃，无CO2条件下讲Sf9昆虫细胞培养至细胞密度达70%-90%。用昆虫转染试剂将MRJP2-Bacmid质粒转染到Sf9昆虫细胞，同时设置转染空质粒的Sf9细胞为阴性对照，继续培养并注意观察细胞形态。待所有细胞都裂解时，收集细胞培养液上清，即为P1代重组杆状病毒。

使用P1代病毒感染贴壁约1h的Sf9细胞（2*106/ml），病毒感染复数为0.1。27℃培养72h后，收集培养液，500xg离心5min，获得的上清为P2代杆状病毒。

用P2代杆状病毒感染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞，密度为1*106-2*106个/ml，MOI为10，感染72h。表达的MRJP2为分泌型蛋白，收集此时的细胞培养液，500xg离心5min并于4℃保存。

5、重组蛋白的纯化及鉴定
将含有重组蛋白的上清液用超滤管进行过滤浓缩，弃流出物，保存截留物。利用AKTA仪器对浓缩后的样品进行纯化。先用Superdex 75 10/300 Increase凝胶过滤柱分离，SDS-PAGE跑胶检测，然后用阴离子交换柱HiPrep Q XL进行进一步分离，SDS-PAGE跑胶鉴定。然后对纯化蛋白进行质谱分析。

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