​趣谈基因疗法(第二期)| 生产似乐高、治疗像快递的基因增补

▉ 写在前面

上一期我们说到基因增补（gene augmentation，又名基因修饰）是目前已上市和实验中的基因疗法中最主要的作用原理，也是当前热度极高的话题之一。

就在本篇撰写之前，该领域又出现了两个大新闻：（1）FDA拒绝了BioMarin 针对A型血友病的药物Roctavian的上市申请，要求补充2年的随访数据；（2）Audentes又爆出一例AT132高剂量给药组的患者死亡，截至目前，高剂量已死亡3例（入组17例）。一边是FDA对该领域的评审更加严格，一边是冒进的临床试验导致患者的死亡，这为当前火热的基因疗法泼了一盆冷水，也让组织者更加重视实验的安全性和数据充分程度，引领行业向更严谨地方向发展。

▉ 基因就是快递

说到基因增补，时下最火热的方法为In vivo的基因递送，我们可以把其比喻成用汽车送快递：以DMD（杜氏肌营养不良）为例，由于X染色体上的基因突变，患者无法生产出足量、正常的抗肌萎缩蛋白，根据蛋白的残存率，也可以对患者做疾病分型。

我们将DMD病人的身体比喻成一座城市，整个城市现在缺少生产抗肌萎缩蛋白的工厂，那么我们的目标则是要将抗肌萎缩蛋白的生产图纸（基因），以快递的方式从外界送到这个工厂（靶细胞）。

但就像送快递一样，每天有各种各样城市自有的车辆在其中穿行和运输，道路十分危险，并且交警不止是要抓违章，还要抓外来车辆；同时，也有着各种各样相似的门牌号和建筑，还得确保快递是被目标工厂接收，而不是送到澡堂、电影院……所以，构建安全高效的送快递的“车”就很重要了。

目前有很多种送快递的方法，在这里简单介绍下：

裸质粒递送：最常见的是直接向肌肉组织注射大量裸质粒（快递），期望裸质粒被肌肉细胞（工厂）内吞后，生产出所需蛋白，此种方法转染效率低，可适用于一些仅需微量表达就能达到治疗效果的疾病；

病毒载体递送：最常见的是以AAV（Adeno-associated Virus）、LV（Lentiviruses）作为载体，其他病毒载体还有如RV（Retroviruses）、HSV（Herpes simplex）等，此类方法转染效率突出，瓶颈主要在于免疫原性、靶向性、随机整合、基因载量、生产成本等方面；可以通过注射方式的改变来实现靶向性和低免疫原性，如视网膜下腔注射（subretinal delivery）；更多常见病毒载体下见图。

非病毒载体递送：如高分子聚合物、阳离子脂质体等，同样受限于转染效率低，使用此类方法的实验并不多，且有研究表明，在投递等量DNA时，使用脂质体比裸DNA投递转染效率更低。

图：常见病毒载体

综合来看，由于转染效率的显著优势，病毒载体脱颖而出。但没有一种病毒是完美的，每一种都有着明显的优缺点，所以实际的选择过程中，需要参考更多的维度，选择不同的载体病毒。参照文献中基因疗法选择决策树（下图）。

图：In vivo基因疗法选择决策树

AAV属于细小病毒科、Dependoparvovirus属，是一种无包膜病毒，包裹一条约4.7kb的单链DNA，因此AAV最佳装载量为5kb以下的基因组，虽然也出现了使装载量大于5kb的技术，但还处于很早期的研究。AAV拥有100余种血清型，宿主广泛，目前学界认为AAV不会引起任何人类疾病。

图：不同组织的血清型选择参考（来源：吉凯基因，仅作学习用途）

工程改造过的可携带外源基因序列的重组AAV（rAAV）包装的基因组删除了全部AAV蛋白编码序列，添加治疗性基因表达盒。rAAV在感染细胞后会形成双链DNA形态，并且头尾相连形成环状，能长期存在而不被细胞系统当作外源DNA降解，因此可以在哺乳动物器官或组织中长期保留，并且只有极低的整合基因组机率。但由于rAAV具有与wtAAV相同的结构组成和衣壳序列，因此也面临着免疫带来的无效压力。

表：常见AAV血清型预存抗体情况

目前AAV面临着载量小、起效慢、无有效动物模型等挑战，临床上的核心挑战还是来自于给药的病毒滴度往往太高；而LV、RV等载体也有着相似甚至更多的挑战，但所有的病毒载体都面临着共同的大挑战：（1）基因毒性；（2）生产成本。

在这里我们仅以AAV为例，对生产成本进行分析，以便更清晰地理解。

▉ 生产好似乐高

前文已经说到，细胞就是个工厂，但细胞不仅可以生产蛋白质，还可以生产病毒。尽管大多数病毒会在感染宿主细胞后自由繁殖，但rAAV需要“帮助者”来进行复制。

rAAV生产方法依赖于AAV基因组复制和包装成病毒粒子需要AAV反式功能（由AAV Rep和Cap蛋白组成）以及AAV辅助病毒功能（主要来自腺病毒或疱疹病毒）被引入相同的宿主细胞。根据将遗传物质引入生产细胞的机制，AAV生产方法可分为三大类：（1）化学，通过质粒材料转染;

（2）生物，通过病毒感染（ HSV，杆状病毒）；

（3）稳定细胞系，可结合其他两种方法的一些步骤。

图：各种rAAV制造策略的利弊

让我们再做一次比喻，细胞就是个包装工厂，组成各种rAAV的各种元件是不同的乐高积木，我们已知的核心积木包括：（1）Rep、Cap或ITR的包装积木——红色积木；（2）辅助元件积木——黄色积木；（3）外源治疗基因积木——蓝色积木。这三种积木在rAAV的生产过程中是必不可少的。

图：乐高积木

稳定细胞株结合辅助病毒（Helper virus）的方法，建立起含有rAAV的Rep/Cap基因或ITR基因组的稳定细胞株（这工厂本来就能生产红色积木），再用辅助病毒来感染生产出rAAV（再把黄色、蓝色积木扔进去组装）。优点是所用细胞可选能作悬浮培养的工业化生产细胞株，适合临床规模生产（产量可以提高）。缺点是稳定细胞株的建立与鉴定需要很长时间（通常需要3个月甚至更长）；细胞株多次传代后的稳定性差；后续纯化过程中要注意完全失活辅助病毒。

三质粒共转染（Helper-free triple transfection）的方法，就像把不同比例的三种积木，通过扔进细胞之中，由细胞自由拼接，可能会出现红红蓝、红黄黄等各种组合，而所需要的仅是红黄蓝这一种。其优点是只需要构建含目的序列的rAAV质粒和普通的转染过程，便捷、高效、病毒空壳率相对低，是目前使用最广泛的rAAV生产方式。目前缺点是由于是基于贴壁细胞基础上的生产导致扩大化生产会有较大困难。

杆状病毒感染（Baculovirus）的方法，将携带各色积木的杆状病毒去感染悬浮培养的SF9昆虫细胞，也可以包装出rAAV，原理类似于前两种方法的结合。优点是能规模化工业化扩大生产，适合临床级别rAAV生产。缺点是杆状病毒或SF9细胞株的建立和鉴定耗时长、影响因素复杂；此外，经此方法生产出来的rAAV感染能力较弱，目前还没有找到确切的原因。

总结三种主流方法，可以发现生产瓶颈在规模化生产上，要么细胞培养难，要么细胞株鉴定难。这么一看好像和乐高关系不是那么密切，那么我们把目光扩大来看。

此前的假设是针对一种疾病，而实际上gene therapy可以针对多种疾病进行设计，每种疾病都需要不同血清型、治疗基因和辅助元件。就像现在我们有很多种红色、黄色和蓝色的积木，我们的目标，是根据不同的适应症选出三个最合适的红黄蓝积木，将其组合在一起进行验证，再迅速搭建三个积木的生产、组装、鉴定流水线，这种模块化、规模化的生产，是工业界所追求的。

在实际生产中，不仅是上游工艺挑战大，下游的纯化和标准建立，都是有很大难度，但幸运的是，这已经是工业界而非学术界的难题了，随着资本的不断涌入，资源投资的增加，突破指日可待。

▉ 总结

每次一提及AAV，就不知道从何说起，说了一大堆后还是觉得没说完。这就是AAV的现状，也是LV、RV的现状，它们不完美，有着诸多让人心动的优点，也有着让人咬牙的缺点，甚至需要付出生命的代价去发现，但它们已经是当下最好的解决方案了。

关于病毒载体，其实还可以多做几篇，本文也仅是从大的方面做了阐述，如觉得本文有不妥之处，还请批评指正。还有很多细节和步骤都值得详细说一说，比如快递又是怎么制造的？汽车的改进方法是什么？下游工艺难题究竟在哪？未来的商业化之路怎么走？在下一篇章里，我们将对快递去做更多地了解，顺道也会说到基因编辑，下期见。

医药速览 发起了一个读者讨论 大家对目前基因疗法或者AAV病毒载体有什么独到的见解，可以留言到下方哦。

参考出处:

https:///san-francisco/2020/08/21

Wang D , Tai P W L , Gao G . Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, doi: 10.1038/s41573-019-0012-9 (2019).

Benskey MJ, Sandoval IM, Miller K, et al. Basic Concepts in Viral Vector-Mediated Gene Therapy. Methods Mol Biol, doi:10.1007/978-1-4939-9065-8_1 (2019).

Nathalie Clément. Large-Scale Clinical Manufacturing of AAV Vectors for Systemic Muscle Gene Therapy[M]// Muscle Gene Therapy. doi:10.1007/978-3-030-03095-7_15 (2019).

Smith, A E. Viral Vectors in Gene Therapy[J]. Annual Review of Microbiology, doi:10.1146/annurev.mi.49.100195.004111 (2003).

Theodore Friedmann and Richard Roblin, Gene Therapy for Human Genetic Disease?, Science, doi: 10.1126/science.175.4025.949 (1972).

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