【原】重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

AAV基因组结构

悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV血清型选择—应用案例

rAAV包装纯化及滴度检测
      AAV包装过程中，包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作用），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒衣壳蛋白）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。和元生物腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。另外，我们也可以根据使用者要求，提供蛋白染色检测衣壳蛋白的完整性以及内毒素含量等。一般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满足各类整体实验的使用要求。

AAV包装流程图

滴度检测方法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。
滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。