 慢病毒技术 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。慢病毒载体（Lentiviral vector）是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基础上改造而成的，能利用逆转录酶和整合酶，将自身的RNA转变为DNA整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。 在研究RNAi方面，慢病毒技术是最为有效的一种解决方案。  实验步骤 前期准备： 1.构建含有目的基因的病毒载体。2.指数生长的293T细胞；3.病毒包装质粒Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2，不同载体系统所用的包装病毒质粒也不一样，此系统可用于包装PLKO，Plv等载体质粒。4.转染试剂：lipo2000。 1.细胞分盘 通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基平铺细胞于35mm 培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80％以上）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前 2h 换液（用1.5ml 完全培养基置换旧的培养基）。 2.混匀核心质粒和包装质粒 取无菌1.5ml EP管，加入400µl 无血清DMEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl turbofect (turbofect ：质粒＝2:1），充分混匀，静置15-20min。 3.孵育 将这400μl 的混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO2的37℃温箱孵育。 4.收集病毒上清 6-10 h后吸去培养基，加入2.5ml37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，40h左右可以收集含慢病毒的上清进行感染或者分装后置于－80℃储存待用。（1500rpm离心五分钟，一般可收集到2ml 含病毒上清） 5.病毒感染 1）将细胞平铺于6孔板或12孔板，最佳密度为30%－70％。 2）对于六孔板：（12孔板减半） Infectmouse cells：800-1600µl virus + 1600-800 µl fresh medium =2.4 ml total Infecthuman cells：200-800µl virus + 1200 µl-800 µl fresh medium =2 ml total 3）加入2-5µg/ml polybrene, 充分摇匀后置于37℃温箱孵育。 4）12-24h 后换液，长满后传代或者检测表达，做实验。 常见问题 Q1. 怎样购买份量合适数量的慢病毒颗粒？ 一套完整实验所需的慢病毒颗粒包括：1. 含有目的基因的慢病毒颗粒，2. 阴性对照慢病毒颗粒，3. 用于预实验的阳性对照慢病毒颗粒。 购买时可以根据目的细胞特性、检测方法、培养器皿估算慢病毒颗粒的最佳用量，避免剩余的大量慢病毒颗粒超出最佳保存期；此外，GeneCopoeiaTM 同时提供高滴度低价格的阳性对照慢病毒颗粒，帮助您以较低的预算和较充足的材料完成预实验的条件探索。初次使用慢病毒颗粒的研究者也可使用阳性对照慢病毒颗粒熟悉实验过程。 Q2. 慢病毒颗粒可以用于动物体内（In vivo）实验吗？GeneCopoeiaTM 提供的即用型慢病毒颗粒全部经过纯化、浓缩处理，去除了细胞碎片等杂质，进一步降低免疫原性，适用于各类活体动物注射实验和成瘤实验。 Q3. 慢病毒颗粒对目的细胞的感染效率很低，如何提高感染效率？提高感染效率的前提是保证细胞生长状态良好。其次，可以通过提高 MOI 值来提高感染效率，也可以在培养基中加入 Polybrene (4-10 µg/mL) 提高感染效率。 Q4. 添加慢病毒颗粒后，细胞为什么大量死亡?慢病毒颗粒对靶细胞有一定毒性。添加量过多、感染时间过长都可能对目的细胞 造成伤害。如遇上这种情况，建议您降低 MOI 值，并在感染细胞 4-8 小时后进行换 液（以新鲜的全培养基替换含慢病毒颗粒的旧培养基），最长换液时间不可大于 12 小时。 Q5.Polybrene 是什么？在慢病毒颗粒感染中，Polybrene 添加越多越好吗？Polybrene 是常用的感染添加剂，通常的使用浓度为 4-10 µg/mL，Polybrene 能 显著提高慢病毒的感染效率，通常能提高感染效率 2-10 倍，对部分细胞甚至可 提高感染效率 10-20 倍。当目的细胞 MOI 高于 20 时，我们建议在培养基中加入 Ploybrene(约 4-10 µg/mL) 适当提高感染效率。在正式使用 Polybrene 前，建议在 1-10 µg/mL 范围内设置梯度，观察细胞在该浓度下，24 小时后是否仍保持健康生长，从而确定该细胞的最适 Polybrene 浓度。 Q6. 目的细胞可以被慢病毒颗粒感染，但 eGFP 的荧光强度很低，为什么？在目的细胞被慢病毒颗粒感染过程中，eGFP 荧光强度取决于病毒感染细胞内的慢病毒颗粒数、细胞本身的状态、细胞类型以及观察时间等。一般情况下，目的细胞感染慢病毒颗粒数越多，细胞增殖越快，eGFP 荧光会较强。慢病毒携带基因表达时间较长，一般在增殖较快的细胞中也需要感染 72-96 小时才会到达 eGFP 的表达高峰。对于增殖较慢的细胞，感染时间则需更长。建议如果您的细胞在感染后观察的荧光强度较低，建议继续培养一段时间再观察。 Q7. 进行慢病毒颗粒感染后，为什么目的细胞用 qPCR 检测不到目的基因表达量的变化？如果使用的检测方法是 qPCR，原因可能是目的基因含特殊序列结构、或与目的细胞系统不能兼容的问题，导致转录受影响，建议同时培养、感染目的细胞和 293T 工具细胞，同时进行检测，如目的基因在 293T 细胞转录不受影响，则可能为目的基因与目的细胞的相互作用导致转录受阻。 Q8. 慢病毒颗粒在储存期间不慎染菌，还可以继续使用吗？如慢病毒颗粒不慎染菌，且实验材料有限，可以使用 0.45 µm 滤膜对慢病毒进行滤菌操作。当然，该操作会导致一定程度的滴度损失及慢病毒颗粒总量损失。如条件允许，建议重新购买该种慢病毒。 东澳服务 产品特点 样本广泛：可以感染各类细胞，包括神经元、间充质干细胞、神经干细胞等，对活体动物也可以进行感染。 轻松感染：利用高滴度的慢病毒，可以轻松感染各类细胞，重复性好，并且较容易获取稳转细胞株。 低毒高效：由于利用生物方式进行转基因，对细胞伤害较低，大大提高了实验对象的成活率，并且再感染效率高。 个性服务：可以根据客户需求，构建干扰载体，表达载体，荧光标记载体，一切本着以人为本的服务理念。 应用范围 本产品适用于多种基因水平的操作，如RNA干扰，表达基因及活体荧光标记等。 实验流程
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