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电针对脊髓损伤小鼠 运动功能及炎性和氧化应激反应的影响 代妮，黄思琴，唐成林，谭程方，代攀，曾婷婷，朱正威，杨之雪 (重庆医科大学中医药学院，重庆400016) 【摘 要】 目的：观察电针对脊髓损伤(SCI)小鼠运动功能的影响，从抗炎及抗氧化方面探讨电针促进SCI小鼠功能修复的机制。方法：雌性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组及电针组，每组12只。采用钳夹法制备小鼠SCI模型。电针组于造模后3 h电针双侧“足三里”“三阴交”，每日1次，连续治疗7 d。采用Basso Mouse Scale(BMS)评分评估小鼠后肢运动功能变化;HE染色法观察脊髓损伤区病理形态学变化;Western blot法检测小鼠脊髓中载脂蛋白E(ApoE)及磷酸化核转录因子⁃κB(p⁃NF⁃κB)、白细胞介素⁃1β(IL⁃1β)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、p⁃ERK1/2、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧化酶⁃1(HO⁃1)的表达;免疫荧光染色法检测脊髓中星形胶质细胞的增生程度。结果：造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠的BMS评分显著下降(P<0.05);脊髓组织结构紊乱，炎性浸润严重，正常神经元大量减少;脊髓中ApoE、p⁃NF⁃κB、IL⁃1β、p⁃ERK1/2、Nrf2、HO⁃1的表达显著升高(P<0.05);星形胶质细胞数量显著增加(P<0.05)。与模型组比较，电针组小鼠的BMS评分显著升高(P<0.05);脊髓组织结构较完整，炎性浸润较轻，正常神经元较多;脊髓中p⁃NF⁃κB、IL⁃1β的表达显著降低(P<0.05)，ApoE、p⁃ERK1/2、Nrf2、HO⁃1显著升高(P<0.05);星形胶质细胞数量显著减少(P<0.05)。结论：电针能够显著改善SCI小鼠的炎性反应和氧化应激反应，抑制星形胶质细胞过度增生，从而促进脊髓功能的修复，其作用机制可能与上调脊髓中ApoE的表达，增强Nrf2/HO⁃1抗氧化途径和抑制NF⁃κB激活有关。 【关键词】 脊髓损伤;电针;后肢运动功能;载脂蛋白E;核因子E2相关因子2/血红素氧化酶⁃1抗氧化途径;核转录因子⁃κB;星形胶质细胞 【KEYWORDS】 Spinal cord injury; Electroacupuncture; Hindlimb locomotion function; Apolipoprotein E; Nrf2/HO⁃1 antioxidant pathway; Nuclear transcription factor⁃κB; Astrocyte 脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)表现为损伤脊髓节段以下肢体出现严重的感觉、运动功能障碍，具有高致残率、高死亡率和低治愈率的特点，是针灸康复治疗的常见疾病之一。目前，SCI的病理过程可概括为原发性损伤和继发性损伤(原发性损伤后发生的一系列细胞内代谢和基因改变，包括神经元坏死、轴突变性、脱髓鞘等)。而炎性反应和氧化应激反应是影响继发性损伤的两个关键因素，故SCI的治疗策略主要是最大限度地减轻炎性反应与氧化应激反应，减少神经元死亡、轴突变性等继发性损害的发生。研究表明，电针具有抗脂质过氧化反应、减轻炎性反应及减少神经细胞凋亡等作用，可改善微循环障碍、缺血和水肿，防止肌肉萎缩。前期研究中亦发现电针可促进神经纤维炎性反应的改善和水肿的吸收。尽管如此，目前关于电针对SCI后抗炎、抗氧化的作用机制尚不明确。有学者发现，载脂蛋白E(ApoE)在神经系统疾病修复过程中表现出抗炎、抗氧化和抗凋亡等特性，尤其在SCI后，脊髓中ApoE在基因和蛋白水平的表达增高了数十倍，小胶质细胞的激活和巨噬细胞的增殖及其介导的炎性反应显著受到抑制。相反，ApoE的缺失会导致SCI后炎性反应、氧化应激反应和神经元凋亡加重。可见ApoE对SCI的修复具有一定的作用。因此，本研究拟通过建立SCI小鼠模型，观察电针干预对小鼠脊髓中ApoE及炎性反应、抗氧化应激因子的影响，探讨电针改善小鼠脊髓损伤后神经功能修复的可能机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 健康雌性C57BL/6小鼠36只，体质量18~22 g，由重庆医科大学实验动物中心提供[清洁级，许可证号：SCXK(渝)2012-0002]。代养于重庆医科大学实验动物中心SPF级动物房，分笼饲养，室温20~24 ℃，相对湿度45%~55%，明暗12 h交替，垫料每日更换，自由摄食、饮水。适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只。整个实验过程中对动物处置符合重庆医科大学伦理委员会标准。 1.2 主要试剂与仪器 抗ApoE抗体、抗核因子E2相关因子2(Nrf2)抗体、抗血红素氧化酶⁃1(HO⁃1)抗体、抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(美国Abcam)，抗磷酸化核转录因子⁃κB(p⁃NF⁃κB)抗体、抗白细胞介素⁃1β(IL⁃1β)抗体、抗细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)抗体及抗p⁃ERK1/2抗体、抗β⁃actin抗体(美国CST)，抗GAPDH抗体、HRP标记的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。0.17 mm×7 mm华龙牌无菌针灸针(北京大名科技有限公司)，华佗牌SDZ⁃Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)，3.7 cm弯全齿血管夹(上海艾德医疗器械有限公司)，T⁃10匀浆机(德国IKA公司)，1⁃14K低温高速离心机(美国Sigma)，MINI蛋白电泳及转印系统(美国Bio⁃Rad)，IX73荧光显微镜(日本Olympus)，切片机(德国Leica)。 1.3 造模方法 小鼠称重后用1%戊巴比妥钠(0.08 mL/10 g)腹腔注射麻醉，俯卧位固定。于后正中线做纵向切口，钝性剥离肌肉暴露出棘突、椎板和横突，行第1腰椎(L1)椎板切除术，充分暴露L1对应的脊髓。改进Paterniti等建立的SCI模型：采用血管夹钳夹该段脊髓25 s，造成该段脊髓重度损伤。0.9%氯化钠溶液冲洗清除残留血液，逐层缝合伤口。麻醉苏醒后，小鼠双后肢瘫痪，大小便失禁，即为造模成功。术后每日帮助排尿，3次/d，至小鼠恢复自行排尿，并做好抗感染工作。假手术组小鼠仅行L1椎板切除术，不损伤脊髓。 1.4 干预方法 电针组：造模后3 h，将小鼠俯卧位固定，根据小鼠常用针灸穴位[15]定位进行针刺，选取双侧“足三里”“三阴交”穴进行电针治疗，直刺3~5 mm，同侧“足三里”和“三阴交”穴连接电针仪的一对正负电极，疏密波(1.5 Hz/7.5 Hz，疏波5 s，密波10 s)，强度以小鼠后肢轻微震颤为度(约1.0 mA)，每日1次，每次10 min，连续治疗7 d。 假手术组和模型组：仅采用相同方法固定，每日10 min。 1.5 观察指标及检测方法 BMS评分(Basso Mouse Scale)：于造模前1 d和造模后第1、7天对小鼠后肢运动功能进行评分。观察小鼠后肢踝关节活动度、协调性、脚爪姿态、躯干稳定性和尾巴姿态。评分为0~9分，评分越低运动功能障碍越重。评分由两名熟悉评分标准但非本课题组人员独立进行，每只小鼠观察 5 min，取两者平均数作为被测小鼠的最终得分。 HE染色观察脊髓组织完整性及炎性浸润程度：造模后第7天，每组各取6只小鼠，4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，0.01 mol/L PBS和4%多聚甲醛经左心室快速灌注固定，取下损伤脊髓(距损伤中心0.5 cm)，4%多聚甲醛后固定12 h，常规脱水，石蜡包埋，连续横向切片，厚度6 μm，室温保存。检测时，切片脱蜡、水化后，行常规HE染色，光镜下观察。 Western blot法检测损伤脊髓中ApoE、p⁃NF⁃κB、IL⁃1β、p⁃ERK1/2、ERK1/2、Nrf2、HO⁃1蛋白的表达：造模后第7天，每组各取6只小鼠，4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉后，快速取下损伤脊髓(距损伤中心0.5 cm)，液氮速冻1 h后保存于 -80 ℃。检测时经过称量、裂解、匀浆、离心提取总蛋白;BCA蛋白浓度测定法测得浓度后，加入上样缓冲液制成蛋白样品;10% SDS⁃PAGE凝胶电泳后转到PVDF膜上;室温封闭2 h;加入ApoE、p⁃NF⁃κB、IL⁃1β、p⁃ERK1/2、ERK1/2、Nrf2、HO⁃1抗体4 ℃过夜;对应二抗室温摇床孵育1 h;滴加ECL化学发光液，暗室曝光1 min，IMAGE STUDIO成像系统采集图像，Image J分析并计算相对表达量(相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值)。 免疫荧光染色法检测脊髓损伤区星形胶质细胞的增生程度：检测时，取上述方法制备的石蜡切片进行脱蜡、水化，枸橼酸钠热修复法抗原修复20 min，37 ℃封闭1 h，GFAP抗体4 ℃下孵育过夜。次日复温冲洗后，CY3荧光标记羊抗兔IgG(H+L)二抗37 ℃孵育1 h。PBS冲洗后加抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜400倍下采图，每张切片选取3个视野，Image J分析并计算GFAP阳性细胞数。 1.6 统计学分析 采用GraphaPad Prism 5.0对数据进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差( ±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用Bonferroni检验。P≤0.05为差异有统计学意义的标准。 2 结果 2.1 各组小鼠BMS评分比较 造模前，假手术组、模型组和电针组间小鼠BMS评分差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第1天，与假手术组比较，模型组小鼠BMS评分显著下降(P<0.05)，电针组与模型组间差异无统计学意义(p>0.05)。造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠BMS评分显著下降(P<0.05)，与模型组比较，电针组小鼠BMS评分显著升高(P<0.05)。见图1。 2.2 各组小鼠脊髓损伤区病理形态学的比较 假手术组小鼠脊髓结构完整，神经元形态正常，胞质丰富。模型组小鼠脊髓结构紊乱，出现大量的空腔，炎性浸润严重，存在大量炎性细胞，正常神经元大量减少。电针组小鼠脊髓结构较完整，炎性浸润程度较轻，炎性细胞较少，正常神经元较多。见图2。 2.3 各组小鼠脊髓中ApoE表达的比较 造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中ApoE的表达显著增高(P<0.05);与模型组比较，电针组小鼠脊髓中ApoE的表达显著增高(P<0.05)。见图3。 2.4 各组小鼠脊髓中p⁃NF⁃κB、IL⁃1β表达的比较 造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中p⁃NF⁃κB、IL⁃1β的表达显著增高(P<0.05);与模型组比较，电针组小鼠脊髓中p⁃NF⁃κB、IL⁃1β的表达显著下降(P<0.05)。见图4。 2.5 各组小鼠脊髓中p⁃ERK1/2、ERK1/2、Nrf2、HO⁃1表达的比较 造模后第7天，与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中p⁃ERK1/2、Nrf2、HO⁃1的表达显著升高(P<0.05)，erk1 p=''>0.05)。与模型组比较，电针组小鼠脊髓中p⁃ERK1/2、Nrf2、HO⁃1的表达显著升高(P<0.05)，erk1 p=''>0.05)。见图5。 2.6 各组小鼠脊髓中GFAP阳性表达的星形胶质细胞比较 假手术组小鼠脊髓中均匀散在分布着GFAP阳性表达的星形胶质细胞。与假手术组比较，模型组小鼠脊髓中GFAP阳性表达的星形胶质细胞数量显著增加(P<0.05)。与模型组比较，电针组小鼠脊髓中GFAP阳性表达的星形胶质细胞数量显著减少(P<0.05)。见图6。
3 讨论 脊髓损伤属于中医学“痿证”的范畴，通常以活血通络、健脾益气、滋肝补肾为治疗原则。《素问·痿论篇》云“治痿者独取阳明”，故本研究用“足三里”(足阳明经合穴)和“三阴交”(肝、脾、肾三经气血交会处)两穴进行电针治疗，具有疏通经络、调和气血、补益肝脾肾的作用。研究发现，电针可以降低SCI后脊髓中促炎因子IL⁃1β和IL⁃6的表达，增加抗炎因子IL⁃10的表达，抑制SCI后的炎性反应。不仅如此，电针还能调节抗氧化相关蛋白，提高抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应，改善脊髓急性损伤。本研究结果显示，电针治疗SCI小鼠7 d后，BMS评分显著升高，且脊髓损伤区炎性浸润程度明显减轻。说明电针改善了小鼠SCI后的肢体运动功能障碍及炎性反应。 炎性反应是导致SCI后继发性损伤的重要病理环节之一。经典的NF⁃κB信号通路是介导机体炎性反应的重要通路。NF⁃κB是该通路的核心转录因子，可调节多种炎性反应因子的转录，在缺血、缺氧等刺激下磷酸化而被激活。NF⁃κB活化后进入细胞核与靶序列结合，调控下游靶基因如肿瘤坏死因子⁃α(TNF⁃α)、IL⁃1β、IL⁃6等炎性反应介质的转录，导致炎性级联反应。因此，通过抑制NF⁃κB的激活可减轻SCI后的炎性反应，防止脊髓组织的继发性损伤。ApoE是中枢神经系统(CNS)中主要的载脂蛋白，参与CNS的脂质代谢和胆固醇转运。近年来不断发现，ApoE还在CNS创伤和疾病中起着抗炎、抗氧化和抗凋亡等神经保护作用。Seitz等发现，小鼠SCI后，ApoE在基因和蛋白水平的表达均会数十倍地增加，同时小胶质细胞和淋巴细胞的激活受到明显抑制，提示ApoE在脊髓修复过程中具有抗炎作用。ApoE基因缺陷小鼠发生SCI后，炎性细胞因子大量释放，且p⁃NF⁃κB的表达显著高于野生型小鼠;补充ApoE模拟物可明显抑制NF⁃κB磷酸化，减少TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的表达，从而减轻神经炎性反应。本研究结果显示，电针治疗SCI小鼠7 d后，ApoE表达显著增高，p⁃NF⁃κB和IL⁃1β的表达显著下降，说明电针能上调ApoE的表达，直接发挥其抗炎作用，亦可通过ApoE抑制NF⁃κB磷酸化，减少炎性细胞因子IL⁃1β的释放，间接发挥抗炎作用。 氧化应激反应是脊髓原发性损伤扩大的另一重要因素。SCI后的氧化应激状态激活MARK信号通路，导致ERK1/2磷酸化，激活下游基因Nrf2和HO⁃1的转录，发挥抗氧化应激作用。Nrf2是一种氧化还原敏感的转录因子，它所介导的信号通路在抗炎和抗氧化应激方面发挥重要作用。Pomeshchik等发现，Nrf2的表达在野生型小鼠SCI后第7天达到峰值。ApoE的表达也在SCI后第7天显著上调，并达到最高水平。另有研究表明，患有糖尿病胃轻瘫的ApoE基因敲除小鼠的抗氧化酶的活性及Nrf2的表达均降低，使得氧化应激反应增强。这些都说明ApoE能够增强Nrf2的表达，减轻氧化应激反应。此外，Nrf2还与NF⁃κB信号通路密切相关。研究显示，NF⁃κB的激活受到抑制后，SCI小鼠脊髓中的Nrf2和HO⁃1水平显著提高。同样地，Nrf2能够通过抑制NF⁃κB信号通路，减轻炎性反应和氧化应激反应。不仅如此，Nrf2还可以抑制SCI后GFAP的表达，防止反应性星形胶质细胞过度增生形成胶质瘢痕，并促进轴突再生，有利于神经功能的恢复。GFAP是星形胶质细胞特异性标志蛋白，其表达水平能够反映星形胶质细胞增生及活化程度。具有功能活跃和增殖的星形胶质细胞能够在SCI急性期保持组织的完整性，减少炎性浸润，防止损伤范围扩大;但亚急性期(损伤第7天后)，反应性星形胶质细胞过度增生形成胶质瘢痕，并分泌轴突生长抑制因子，阻碍神经修复。故SCI后，抑制反应性星形胶质细胞过度增生，能为脊髓组织和功能的修复创造良好的条件。本研究结果显示，电针治疗后，Nrf2和HO⁃1表达变化与ApoE一致，且反应性星形胶质细胞增生程度降低。说明电针能通过上调ApoE的表达来提高SCI后的抗氧化应激能力，改善氧化应激反应，并防止反应性星形胶质细胞过度增生。 综上所述，电针能够改善小鼠SCI后的炎性反应与氧化应激反应，抑制反应性星形胶质细胞过度增生，从而促进脊髓结构及功能的修复。其作用机制可能与上调ApoE的表达，增强Nrf2/HO⁃1抗氧化途径和抑制NF⁃κB激活有关。（选自《针刺研究》杂志2019年第11期） |
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