放牧引起的微生物组变化驱动草甸草原土壤有机碳的转化和生产力的提高Grazing-induced microbiome alterations drive soil organic carbon turnover and productivity in meadow steppe Microbiome Impact Factor 10.465 | CiteScore 9.86 https:///10.1186/s40168-018-0544-y 发表日期:2018-09-20 第一作者:Weibing Xun(荀卫兵)1,2 通讯作者:Xiaoping Xin(辛晓平)(xinxiaoping@caas.cn)3and Ruifu Zhang(张瑞福)(rfzhang@njau.edu.cn)1,2 合作作者:Ruirui Yan(闫瑞瑞), Yi Ren(任轶), Dongyan Jin(金冬梅), Wu Xiong(熊武), Guishan Zhang(张桂山), Zhongli Cui(崔中利) 主要单位: 1南京农业大学江苏省有机固体废弃物利用重点实验室(Jiangsu Provincial Key Lab for Organic Solid Waste Utilization, National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers, Jiangsu 3中国农业科学院农业资源与农业区划研究所(National Hulunber Grassland Ecosystem Observation and Research Station,Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) 写在前面分享标题:Microbiome:微生物组变化驱动土壤有机碳转化和生产力的提升 关键字:温带草甸草原,牛放牧,微生物组成,土壤培养,土壤有机碳降解酶活性,土壤生产力 点评:作者通过设置不同的放牧强度梯度研究了不同的放牧强度对土壤微生物群落的影响及其对土壤生产力的影响;由于土壤微生物易受土壤水分和温度以及许多其他特征的(季节变化)影响,同时为了研究土壤有机碳周转化对季节变化的响应,因此作者结合微宇宙培养实验进一步设置了温度及含水量梯度以期更严谨的更全面的解答放牧对土壤微生物群落,SOC转化和土壤生产力的综合全面的影响,本文工作量大信息量大,论据充实,通过一系列的实验结果结合精彩的讨论有力的论证了放牧对土壤微生物群落组成、多样性、活性和稳定性的变化的影响,并论证了微生物对土壤有机碳的转化和生产力的贡献。 摘要背景放牧是草地生物多样性和生产力的重要调节因子。然而,我们对放牧引起的地下群落、过程和土壤生产力变化的认识是有限的。在此,我们通过长期封闭的放牧草甸草原,调查了季节性变化下放牧对土壤有机碳(SOC)转化,微生物群落组成,抵抗力和活性以及微生物对土壤生产力的影响。 结果结果表明,放牧对草甸草原土壤微生物群落和生态系统功能有显著影响。在轻度放牧强度下,微生物的α多样性最高,而在中等适度放牧强度下微生物的β多样性最高。放牧使微生物组成由真菌主导型转变为细菌主导型,由缓慢生长型转变为快速生长型,从而导致以真菌为主导且以顽固性有机碳为主的食物网向以细菌为主导且以不稳定有机碳为主的食物网的转变。此外,分别在真菌和细菌主导的群落中观察到较高的真菌顽固性SOC降解活性和细菌不稳定SOC降解活性。值得注意的是,细菌群落的鲁棒性和细菌活性的稳定性与α多样性有关,而真菌群落及其相关活性的鲁棒性却并非如此。最后,我们观察到是微生物α-多样性而不是SOC的转化可以预测土壤生产力。 结论我们的发现表明,放牧对土壤微生物群落,SOC转换和土壤生产力具有强烈影响,且土壤微生物α多样性在控制草甸草原生态系统功能方面具有重要的积极作用。 背景放牧是最广泛的土地用途之一,占全球土地面积的三分之一以上。据报道,过度放牧会降低植物区系多样性和生物量,可能是草地退化最普遍和最显著的过程。植物区系多样性对生产力和其他生态系统功能的重要性已被许多研究证实。然而,植物区系多样性的重要性最近受到了质疑。其中一些问题表明,许多陆地生态系统的生产力取决于资源的有效性。特别是土壤微生物,由于其在凋落物分解、生物地球化学养分循环、土壤团聚和促进肥力等方面的关键作用,其是维持生态系统功能和提高土壤生产力的重要组成部分。因此,促进从地面研究向地下研究的转变,对提高我们对土壤微生物行为的认识具有重要意义。这些研究可以为生态学家提供深入了解地面上观察到的看似不同的结果的见解。到目前为止,虽然一些调查已经研究了自上而下的相互作用,但我们对土壤微生物群落和生态系统维持土壤生产力的机制的认识是有限的,特别是放牧引起的地下群落的变化。 众所周知,土壤微生物群落的组成和功能性能都可能受到气候,植被和土壤条件等环境变量的强烈影响。在草原生态系统中,放牧是一个关键的调节因子,它可以直接或间接地影响上述环境变量,进而影响土壤微生物群落的多样性和组成,从而改变土壤的功能性能和养分供应模式。事实上,一些研究表明,放牧对土壤微生物群落和土壤碳(C)和氮(N)的有效性有显著影响。不同的放牧强度可能改变土壤细菌和真菌的分布,影响土壤呼吸。尽管有这些发现,但关于放牧对草地生态系统中地下微生物群落和土壤固碳能力及生产力的影响的研究却很少。因此,需要进一步研究这些自顶向下和自底向上综合的相互作用。 内蒙古草原是欧亚草原的重要组成部分,位于欧亚草原东缘的呼伦贝尔草原是最具代表性的温带草甸草原,土壤肥力和生物多样性高。这片草地在高放牧强度下会发生物种的减少,这对于我们的研究是有利的。因此,为了探索放牧对土壤微生物群落的影响及其对土壤生产力的影响,我们于2009年在中国农业科学院呼伦贝尔草地生态系统研究站(HGERS)进行了长期放牧强度梯度试验。我们对16S和内部转录间隔区(ITS)进行了rRNA基因扩增子测序,以评估土壤微生物群落的结构。对于微生物对SOC转化的影响进行了多种SOC-酶解法的研究。本研究的目的是调查放牧引起的土壤微生物群落组成、多样性、活性和稳定性的变化,并研究微生物对土壤有机碳的转化和生产力的贡献。 结果放牧的集约化促发了快速生长的细菌主导的群落Intensification of grazing triggers fast-growing and bacteria-dominated communities 放牧对土壤细菌和真菌丰度有显著的影响,而季节变化则没有。细菌丰度在G2和G4组较高,在G8组较低(图. 1a)。而G0的真菌丰度最高,且随放牧强度的增加而降低(图. 1b)。过度放牧(G8)导致了细菌和真菌数量的显著减少。当计算细菌/真菌比例时,我们发现较高的细菌/真菌比例与较高的放牧强度相关,这表明随着放牧强度的增加,细菌变得盛行(图. 1c)。 图 1 a Lg转换的细菌丰度,b Lg转换的真菌丰度,c 所有放牧强度下的细菌/真菌比a Lg-transformed bacterial abundance, b Lg-transformed fungal abundance, and c bacteria/fungi ratio at all grazing intensities
我们的测序结果表明,响应于牛放牧的细菌和真菌群落存在显着差异。在中度以下(G0和G2)和中度至重度(G4和G8)放牧强度之间观察到最强烈的差异。就土壤细菌而言,大多数Acidobacteria,Chloroflexi,Planctomycetes,与Verrucomicrobia等门水平缓慢生长的细菌在G0和G2中含量更高。而生长最快的Bacteroidetes,Firmicutes,Nitrospira,和Proteobacteria等门水平的细菌在G4和G8中含量更多,最丰富的真菌门是Ascomycota, Basidiomycota, Glomeromycota,和Zygomycota。其中,Ascomycota是最常见的门,相对丰度为80.6 ~ 89.9%。此外,在G0和G2中,来自Glomeromycota和Zygomycota及一些属于Ascomycota(Geoglossomycetes,Pezizomycetes,Sordariomycetes等)的类更丰富。值得注意的是,季节变化对微生物组成的影响比放牧要小。 放牧影响微生物群落的多样性和鲁棒性Grazing affects the diversity and robustness of microbial communities 我们通过使用α-diversity(在相同位点水平的物种丰富度),γ-diversity(在地块水平上的物种丰富度),和β-diversity(同一地块取样点间群落相异度)同时进行对土壤微生物多样性的评估。首先,轻度放牧强度(G2)导致最高的土壤微生物α多样性,而高放牧强度(G8)导致最低的α多样性,其显著性由样品的Shannon指数(图.2a)和OTU丰富度表明。同时,中等放牧强度(G4)的地点具有与G0相同水平的微生物α多样性。其次,观察到微生物的γ多样性在G2中最高,在G8中最低。但是,在小区水平上,G4具有与G2相同的物种丰富度。第三,使用未加权和加权Unifrac距离计算微生物群落的β多样性,G4的群落表现出最大的β多样性,其次是G2,G0和G8。 图 2
非度量多维标度(NMDS)分析用于比较微生物群落。根据放牧强度,细菌群落在第一个主坐标上被区分开来(图. 2b)。分离的模式与放牧强度梯度一致,即由低放牧强度梯度的G0和G2到中度放牧强度的(G4)再到高放牧强度(G8)的梯度。此外,群落在第二个主轴中,被季节变化分隔开来,表明土壤细菌群落对季节变化也有响应。此外,真菌群落也观察到类似的分离模式。 放牧对草地微生物群落组成和多样性有重要影响,这可能改变草地微生物群落的鲁棒性。事实上,群落的鲁棒性与其对季节变化的反应有关。因此,我们使用标准化的OTU相对丰度进行了OTU差异分析,并于6月和8月在每个放牧强度水平下收集的土壤样品之间进行了对数比测试,以确定群落的鲁棒性。正如扫帚形的“尾巴”所表示的那样,其中更发散的“尾巴”表示弱鲁棒性,G8(图. 3d)细菌群落的季节变化大于G4(图. 3c)菌群,其次是G2(图. 3b)和G0(图. 3a)菌群,说明随着放牧强度的增加,细菌群落的稳定性下降。相比之下,真菌群落的季节变化在所有放牧强度下波动较大(图. 3e to 3h)。 图 3 6-8月各放牧强度下标准化OTU丰度的季节变化Seasonal variations of normalized OTU abundances between June and August for every grazing intensity
放牧改变了土壤有机碳的降解和功能的稳定性Grazing alters SOC decomposition and functional stability 为了研究土壤有机碳周转化对季节变化的响应,我们通过改变土壤含水量和温度条件进行了土壤培养试验(湿度、温度通过田间调查确定)。我们测定了土壤中各种酶的活性,包括SOC降解酶的活性(范围从不稳定的到难分解的SOC的降解)。 我们发现,不同培养条件下土壤酶活性是不同的,而微生物丰度却没有(qPCR数据未显示)。有趣的是,不稳定SOC的降解酶(转化酶、麦芽酶和淀粉酶)活性与细菌丰度呈正相关(R ≥ 0.597, P ≤ 0.019),与真菌丰度呈弱相关(R ≤ 0.286, 无显著性)(表 1)。然而,难降解SOC的降解酶(果胶酯酶、纤维素酶、木聚糖酶)活性与真菌丰度呈正相关(R ≥ 0.659, P ≤ 0.009),与细菌丰度呈弱相关(R ≤ 0.262, 无显著性, 表 1 SOC降解酶活性与细菌、真菌丰度的斯皮尔曼秩相关Spearman’s rank correlations of SOC-decomposing enzyme activities with bacterial and fungal abundances
为了合理评价微生物活性,我们计算了酶活性与微生物丰度的比值(计算中只使用了显著相关的活性和微生物丰度)。土壤微生物活性对水分和温度扰动的响应不同;在温度或水分梯度下,细菌活性最高的是G4,最低的是G8。但是,在温度或水分梯度下,真菌活性最高的是G0,最低的是G8。同时,在相同放牧强度下,由于水分和温度扰动下真菌活性的高变异性,真菌活性似乎比细菌活性更敏感。 通过微生物活性的正态分布来验证在不同水和温度条件下微生物活性的稳定性(图. 4)。最右边的矩形表示微生物活性更高,而较小的矩形表示微生物活性在微扰下更稳定。在本分析中,G4的细菌活性最高,而G0的细菌活性最稳定。此外,细菌活性最强的单独预测因子是细菌β-多样性(R = 0.794, P = 0.002),土壤细菌活性也显著相关于土壤pH值(R = 0.726, P = 0.004)、细菌γ-diversity(R = 0.692, 图 4 在不同的培养条件下,微生物活性呈正态分布Normally distributed microbial activity under various incubation conditions
表 2 微生物活性与微生物多样性、丰度、土壤pH值和SOC浓度的斯皮尔曼秩相关(使用Mantel检验估算)Spearman’s rank correlations of microbial activity with microbial diversity, abundance, soil pH, and SOC concentration (estimated using Mantel tests)
土壤生产力相关于微生物的α-多样性Soil productivity is related to microbial α-diversity 利用地下SOC浓度以及地面植物和牲畜生物量来估算土壤生产力。根据Mantel检验结果,我们发现微生物活性与土壤生产力之间存在微弱的相关性。然而,线性回归分析结果显示,6月和8月的细菌和真菌的Shannon多样性指数与SOC浓度呈显著正相关(图. 5a, b)。同时,我们发现微生物Shannon多样性指数与平均植物生物量积累(R2 ≥ 0.562, P < 0.01 for bacteria, 图. 5c; and R2 ≥ 图 5 微生物α-多样性与SOC浓度(a 细菌; b 真菌)、平均植物生物量积累 (c 细菌; d 真菌)、平均牲畜生物量积累(e 细菌; f 真菌)的线性回归分析Linear regression analysis between microbial α-diversity (Shannon index) and SOC concentration (a bacteria; b fungi), average plant biomass accumulation (c bacteria; d fungi), and average livestock biomass accumulation (e bacteria; f fungi) 讨论放牧使微生物群落从由真菌主导、缓慢生长型向细菌主导、快速生长型转变Grazing shifts microbial communities from fungi dominated and slow growing to bacteria dominated and fast growing 不同放牧强度对土壤环境条件和微生物群落有直接和间接的影响。家畜以地上植物为食,并将其中近一半转化为粪便,这有利于细菌的生长。然而,在过度放牧的情况下,过多的践踏会导致土壤的容重过高,而植物覆盖度的缺乏又会引起土壤湿度和温度的剧烈波动,使得土壤微生物的生长环境十分恶劣。因此,我们观察到细菌丰度的跳跃变化。此外,细菌/真菌比率的增加表明,在较高的放牧强度下,细菌已成为主导微生物,而土壤真菌的丰度下降了,这可能是因为真菌喜爱较少扰动的生态系统。 关于放牧对微生物群落组成的影响,我们观察到不同的微生物类群表现出不同的行为。由于长期的双核生物状态,许多担子菌群对环境扰动和生长缓慢敏感,其可以用作扰动强度的真菌指示剂。此外,被称为丛枝菌根真菌(AMF)的Glomeromycota门与植物生物量密切相关。因此,由于土壤扰动加剧,植物丰度和生物量下降,集约放牧条件不利于这些真菌的定殖。 特别是,虽然地上植物几乎一半以粪便的形式归还,但集约放牧条件下有限的牧草可能会迫使牛消耗更多的能量在场址周围觅食,从而增加地上牧草的消耗和地下养分的周转,从而降低SOC的浓度。而在该地区,集约放牧增加了Bacteroidetes, 放牧同时改变了土壤细菌和真菌的多样性,但对细菌和真菌群落的鲁棒性有不同的影响Grazing alters soil bacterial and fungal diversity simultaneously but has different impacts on the robustness of bacterial and fungal community 放牧可能通过改变优势微生物之间的竞争相互作用和释放/抑制从属微生物来调节土壤微生物的多样性;然而,过度放牧可能会对微生物多样性产生负面影响。在这项研究中,G0和G4的微生物的α多样性均显著低于G2,但G4的γ多样性与G2处于同一水平。这些数据表明,轻度放牧对局部和区域尺度上的土壤微生物物种丰富度都有积极的影响。但是,适度放牧降低了局部范围内的微生物物种丰富度,但对区域范围内的微生物物种丰富度影响不大。在中等放牧强度下,不同尺度下物种丰富度的这些变化导致了高水平的β多样性。事实上,我们使用unweighted和weighted Unifrac 距离都证实了观察结果。此外,这一观察结果与Cline等人之前的研究结果一致,Cline等人进行了长期的有蹄类动物觅食强度试验,并指出觅食强度与细菌丰富度(α-diversity)降低和明显的细菌群落(β-diversity)增加有关。他们还预测,高觅食强度将导致土壤生物α-和β-多样性的更大程度的降低。特别是,Griffiths等人认为,这些多样性的变化主要对应于更大的环境变化。我们认为,这些发现可能是由于选择性摄食造成的,这导致了当地营养供应和需求模式的改变,从而导致区域尺度上更大的环境异质性。 除了放牧的强烈影响外,季节变化对土壤微生物群落的影响也是同步的。从图3的扫帚状“尾巴”可以看出,随着放牧强度的增加,土壤细菌群落的变化也越来越大。由于土壤微生物易受土壤水分和温度以及许多其他特征的影响,因此这些差异可能归因于季节变化。例如,放牧会导致植物覆盖率下降,从而导致土壤水分快速流失和土壤温度急剧波动。因此,集约化放牧使土壤更容易受到季节波动的影响,并降低了土壤微生物的多样性,因此,集约化放牧可能会降低群落的鲁棒性。然而,与细菌群落相比,真菌群落在所有放牧强度下都有很大的差异。我们认为,植物的生长可能是引起真菌群落季节性变化的主要因素。这与Millard和Singh证明的细菌群落更受土壤特征的影响,而真菌群落主要受植被的影响是一致的。 微生物组成和鲁棒性决定了SOC的分解活性和稳定性Microbial composition and robustness determine the SOC decomposition activity and stability 土壤细菌和真菌对SOC库的影响不同;因此,放牧通过改变土壤中微生物的丰度和组成来影响SOC组分的大小和组成。一般来说,集约化放牧地需要更多的可利用养分来促进植物生长。因此,土壤微生物被迫形成一个群落,该群落表现出更高的养分转化率。迄今为止,我们知道集约型放牧导致了土壤中细菌主导的食物网。我们的结果与这些观察结果一致,表明细菌,尤其是快速生长的嗜营养菌在集约化牧场占主导地位。我们检测了几种SOC分解酶的活性,以概述SOC的分解能力。SOC分解酶活性与微生物丰度之间的独特关系表明,真菌在顽固的SOC转化中更重要,而细菌在不稳定的SOC转化中更重要。例如,真菌比细菌更有效地分解木质纤维素。此外,更多的嗜营养菌含有更多的不稳定SOC分解基因,这促进了不稳定SOC的转换。因此,土壤细菌或真菌的优势度调节了SOC的分解。 为了正确地表征微生物的平均活性,我们计算了酶活性与微生物丰度的比值。这个比率类似于代谢商数(qCO2),它被定义为每单位生物量的呼吸速率。我们观察到土壤细菌活性(不稳定SOC的分解)在G4中最高,表明适度放牧增强了土壤细菌活性,而过度放牧则抑制了土壤细菌活性和不稳定SOC的分解能力。另一方面,在非放牧地点(G0),土壤真菌活性(顽固性SOC的分解)最高,这表明放牧的引入抑制了土壤真菌活性和分解顽固性SOC的能力。这一发现支持了以下假设:细菌和真菌分别是集约化放牧和轻度放牧草地上相对更重要的分解者。 我们观察到预测细菌活性的最佳参数是细菌β多样性,其次是土壤pH值。显而易见的是土壤pH值对细菌的存活和活性有很强的影响;然而,很少有报告细菌β-diversity的影响。我们认为G4中细菌活性高的主要原因是嗜营养菌所占比例高。因此,适度放牧可以促进草甸草原嗜营养菌的生长,增强细菌活性。然而,在过度放牧的土地上,嗜营养菌的活性会受到抑制。与细菌群落不同,真菌群落与土壤pH值关系较弱,后续研究证明土壤真菌多样性和组成与SOC有关,而SOC与草地植物生长有关。此外,Keiblinger等人认为真菌的SOC分解效率对植被更为敏感,需要较高的真菌生物量。因此,真菌丰度与顽固性SOC分解效率的关系可以作为预测真菌在自然生境中活性的良好指标。 我们还发现,在集约化放牧点的细菌活动和所有放牧点的真菌活动均存在很大的波动,这分别与细菌和真菌群落的鲁棒性有关。我们的发现与之前的结果一致,表明微生物的鲁棒性决定了土壤功能的稳定性。重要的是,在不同的培养条件下,虽然我们没有发现真菌的丰度有明显的变化,但真菌的活性表现出相同的波动趋势,这说明真菌的活性也对湿度和温度敏感。综上所述,这些发现表明土壤细菌活性主要在于丰富的嗜营养类群和土壤特性,而这些丰富的嗜营养类群是影响不稳定SOC分解效率的主要因素。此外,真菌活性主要受真菌丰度和植株生长的影响,是影响顽固性SOC分解效率的主要因素。 土壤微生物的α多样性而非SOC转化率可预测土壤生产力Soil microbial α-diversity rather than SOC turnover rate predicts soil productivity 一般来说,在没有自然生态系统干扰的情况下,植物区系的复杂性决定了土壤的生产力。生态学家一直试图利用受人类或食草动物干扰的生态系统的植物区系多样性来预测生态系统服务x(例如,土壤生产力),但结果却喜忧参半。Van Der Heijden等人总结说,封闭的养分循环发生在受真菌主导的食物网影响较小的土壤中,这些土壤通常支持缓慢的植物生长和较低的净初级生产力。然而,我们发现,中度放牧诱导的细菌为主的食物网和更快的不稳定SOC转化也没有实现最高的生产力。我们推测,在以细菌为主的食物网中,快速的营养循环为快速生长的细菌提供了适宜的生长条件,这可能会使SOC库从C汇向C源转变,从而抑制植物的生长和生产力。在本文中,我们发现微生物α多样性对土壤碳储量和生产力有强烈积极的影响,这表明可能存在内部微生物学机制,以更高的微生物α多样性而不是更高的养分周转率来增加土壤C库和食物链中光同化物的比例。因此,土壤管理强度和土壤微生物群落的相关变化可以引导生态系统的多种功能以及人类需求之间的权衡取舍,且仍然需要关注生态系统的功能。 结论Conclusions 结果表明,不同放牧水平对草甸草原土壤微生物群落和生态系统功能有显著影响(图. 6)。放牧使微生物组成从生长缓慢的真菌主导群落转变为生长迅速的细菌主导群落。我们观察到真菌群落主要负责难降解的SOC的分解,并且真菌活性与真菌丰度呈正相关。另一方面,细菌群落主要负责不稳定的SOC的分解,且细菌活性与β多样性相关。然而,在过度放牧的土壤中,微生物活性受到抑制。特别是,土壤生产力与细菌或真菌的活动无关,而与微生物的α多样性有关。因此,我们认为放牧会通过调节土壤微生物群落和养分转化来影响土壤生产力,而高的土壤生产力主要由微生物α-多样性决定,但在草甸草原上并不需要很高的微生物活性。 图 6 放牧对土壤微生物群落和土壤生产力影响的概述An overview of the influence of grazing on soil microbial community and soil productivity 方法研究方案设计Study design 实验场地位于中国农业科学院呼伦贝尔草原生态系统研究站(CAAS) (119° 土壤样品采集和分析Soil sample collection and analysis 分别于2015年6月(对于分别从处理G0, G2, G4, 和 G8中收集的土壤分别记为J0、J2、J4和J8)与8月(对于分别从处理G0, G2, G4, 和 G8中收集的土壤分别记为A0, A2, A4, 和 A8)采集土壤样品。为了能够同时检测到α和β多样性,我们建立了一种嵌套的采样方法,其中所有采样点都位于半径为150 m,15 m,1.5 m和0.15 m的同心圆上。通过这种采样策略,每个样地总共收集了17个样本。土壤样品取自地块中的直径为10厘米的土壤岩心上部20厘米(去除枯枝落叶层)。所有样品均用标准方法筛选、均质、再细分。用于测定理化性质的土壤被风干,用于分子分析的土壤被保存在-80℃,直到提取脱氧核糖核酸(DNA),用于建立微宇宙的土壤被保存于室温。在中国农科院祁阳红壤实验站对所有土壤样品的土壤性状进行了评估,所使用的详细方法在前面已经描述过。 微宇宙培养Microcosm incubation 在本田间试验中,不同的放牧强度导致了不同的植被覆盖度,导致了地块土壤含水量的差异,影响了土壤温度。土壤含水量和温度是影响土壤C分解的重要因素。因此,考虑到放牧引起的原位含水量和温度条件的差异,并为了准确评估放牧对潜在SOC分解速率的影响,我们建立了土壤微宇宙,并在不同的水分含量和温度条件下培育了这些微宇宙。G0的含水量(22%)定义为田间含水量的100%;选择75%和50%的田间水分含量作为水分扰动处理。温度扰动采用温度梯度(24℃、33℃和42℃,与6月至8月间的温度变化一致)。 土壤微宇宙是按照Xun等人的描述制备的。每个土样建立18个重复的微宇宙(因此, 我们有18个微宇宙实验×17个土样×3小区重复= 918 每一放牧密度918个微宇宙),每个微宇宙是通过将150克的新鲜土壤放入一个250毫升的瓶子中来构建的。加入无菌水,使水分保持在田间含水量的100%,微宇宙在黑暗中24℃预孵育。预孵育1周后,在18个重复的微宇宙中随机选择16个进行湿度和/或温度扰动测试,其余2个微宇宙和之前一样继续孵育(对照, 不扰动, 水分为100%的田间含水量,温度为24℃)。附加文件4:Table S2描述了详细的孵化条件。孵育期为2个月。 酶活分析Enzymatic activity analyses 进行了以下酶活性测定:(i)转化酶(EC 3.2.1.26),麦芽糖酶(EC 3.2.1.20),淀粉酶(EC 3.2.1.1),木聚糖酶(EC 3.2.1.8),纤维素酶(EC 3.2.1.4)和果胶酯酶(EC 3.1.1.11)的活性 )分别以蔗糖,甲基多糖苷,淀粉,木聚糖,羧甲基纤维素和果胶为底物,采用3,5二硝基水杨酸比色法测定;(ii)使用改进的比色法,以硝基苯基糖苷为底物,测定β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的活性。 DNA提取,qPCR,扩增子测序DNA extraction, qPCR, and amplicon sequencing 用PowerSoil DNA提取试剂盒从0.25 g土壤中提取总DNA(Mo Bio Laboratories Inc.,Carlsbad, CA, USA) 。为了使DNA提取偏差最小化,在进行聚合酶链式反应(PCR)之前,将每个土壤样本的连续三次提取的DNA汇集在一起。使用NanoDrop ND-2000分光光度计(NanoDrop, ND2000, Thermo Scientific, Wilmington, USA)根据260/280 nm和260/230 nm的吸光度比值评估DNA质量。提取的DNA保存在- 20℃,直到使用。 使用Power SYBR Green PCR Master MIX (Biosystems, Warrington, UK)在ABI 7500 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, CA, USA)上通过定量PCR (qPCR)分析细菌和真菌的丰度。使用的引物如下:F347(5-ggaggcagtrrggat-3)和R531 (5-ctnygtmttggctgc-3)(194bp)用于检测细菌16S rRNA基因丰度,FungF(5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3)和FungR(5-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3)用于检测真菌18SrRNA基因丰度。 利用引物515F (5 -GTGC CAGCMGCCGCGGTAA-3)和806R (5 -GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3)扩增细菌16S rRNA基因的V4高变区以评价细菌群落。利用引物ITS3 (5 -GCATCGATGAAGAACGCAGC-3)和ITS4 (5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)扩增真菌rRNA基因的内转录间隔区(ITS2)以评价真菌群落。PCR扩增子按等摩尔比混合,测序由Bion Biotechnology Co., Ltd (南京, 中国)在Illumina MiSeq平台上进行,分别对16S及其ITS rRNA基因扩增子池进行测序。使用UPARSE流程处理测序数据(http:///usearch/manual/uparse_pipeline.html)。对原始序列进行质控。去重复后删除单克隆序列和嵌合体序列,其余序列以97%的相似度聚成可操作分类单元(OTU) 数据分析Data analyses 测序数据分析如下:(i)每个物种分类的百分比被指定为相对丰度(ii)物种分类的α多样性的计算方法是单个采样点的OTU丰富度和Shannon多样性,(iii)将物种分类的γ多样性计算为实验小区的OTU丰富度,及(iv)β-diversity(系统发育群落相异度)使用FastUnifrac计算。采用Duncan多重比较检验计算样本间的统计学意义。采用Tukey’s HSD检验计算两样本间的统计学意义。使用Mantel检验和Spearman相关计算相关系数。所有统计分析均采用R软件(version 3.3.2)中的Vegan包(v.2.4-1)。 编译:马腾飞 南京农业大学 责编:刘永鑫 中科院遗传发育所 ReferenceWeibing Xun,Ruirui Yan,Yi Ren,Dongyan Jin,Wu Xiong,Guishan Zhang,Zhongli Cui,Xiaoping Xin,Ruifu Zhang. Grazing-induced microbiome alterations drive soil organic carbon turnover and productivity in meadow steppe.Microbiome (2018) 6:170 doi: https:///10.1186/s40168-018-0544-y |
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