它是检测细胞运动中一种成本极低又简单易行的体外试验方法。 原理:当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像,通过比较图像以确定细胞迁移速率。 实验步骤: 1.划线:先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线 2.铺板:处于对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化成单细胞悬液,接种于6孔培养板;细胞铺板6×105个细胞/孔,确保第二天细胞能够长满,每孔最终的培养基总量2mL; 3.细胞培养37℃、5%CO2培养箱中培养24h 4.划痕:第二天用*头比着直尺,尽量垂直于背后的横线划痕,*头要垂直,不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只*头) 5.清洗:PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基 6.拍照:4倍镜下进行拍照,保证划痕居中且垂直,注意背景一致,可按0,6,12,24h时间点取样,拍照(具体时间依实验需要而定 但是! 在此之前有个非常重要的步骤,选择细胞一定要注意: 1.避免选择生长特别缓慢的细胞(例:内皮细胞) (内皮细胞) 2.避免选择贴壁不牢的细胞(例:神经母细胞瘤) (神经母细胞瘤) 3.避免选择堆积生长或长不满的细胞(例:巨噬细胞) (巨噬细胞) 实验过程中出现的一些常见问题及解决方案: 问题 1 :细胞划痕时发现细胞没有长满,或是长的太满? 解决 1 :铺板时的数量须根据细胞的形态、增殖速度、大小进行调节,细胞较小或增殖速度慢,铺板数量需多于6 ×105个细胞/孔;细胞较大或增殖速度较快则需少于6 ×105 个细胞/ 孔; 问题2 :细胞铺板时, 前面铺的孔细胞密度稀, 后面铺的孔细胞密度密? 解决2 :细胞铺板, 细胞单细胞悬液混合后, 铺板过程中需要边 铺板边晃动管子, 保证细胞在悬液中均匀分布; 问题3 :拍出来的照片背景颜色不一或亮度不一? 解决3 :在拍照前进行白平衡;固定曝光时间。 |
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