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文章来源：仪器信息网，版权归原平台所有 作者：吴潇韫，德国耶拿公司生命科学部产品经理 说起PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术，生命科学领域从业人士肯定不会陌生。PCR技术问世已有30多年，期间创新性生物技术不断涌现，然而PCR技术的地位依然不可撼动——在三十多年后的今天，PCR作为一项必不可少的技术手段，仍被广泛应用在基因克隆、基因表达分析、病原体检测、疾病诊断、基因测序、生物制药、基因/细胞治疗、分子育种、物种鉴定、法医鉴定等各个领域。 2020年的新冠疫情席卷全球，新冠病毒实验室检测起到核心作用的，正是PCR技术。 到底什么是PCR技术? 简单说来，PCR技术是利用DNA双链复制的原理，在生物体外大量扩增特定DNA片段的技术，下图展示了PCR的基本过程。 传统的PCR实验结束后，产物需要通过电泳及成像来查看扩增条带，获得定性结果。20世纪90年代中期，在传统PCR技术的基础上诞生了荧光定量PCR技术，简称qPCR技术。 qPCR可以对起始模板进行实时的检测，具有特异性好、检测灵敏度高、结果直观、省时、安全等优点，被更多地应用在检测诊断领域。在基础科研方面，qPCR也是基因表达分析研究的主要方法。 21世纪初，PCR技术又迎来了第三次创新，出现了数字PCR技术，无需标准曲线就可实现精确定量，但由于其仪器平台和试剂耗材使用成本都远高于qPCR，且操作繁琐，所以目前仍是传统PCR和荧光定量PCR技术应用最为广泛。 与前后三代PCR技术相对应的，当前市面上主要有三种类型的PCR仪，即普通PCR仪、荧光定量PCR仪和数字PCR仪。 一台PCR仪的关键零部件有哪些? 从仪器构成来说，普通PCR仪主要由热循环系统组成，荧光定量PCR仪和数字PCR仪除了热循环系统外，还含有光学检测系统以及配套的操作分析软件。 温控性能决定PCR反应成败 温控性能是PCR反应最重要的影响因素之一 由PCR原理也可看出，PCR反应是不断升温和降温的过程。需要能在变性-退火-延伸这三个关键步骤进行温度控制。温度控制涉及温度准确性、均一性、升降温速率、温度梯度等多个方面。 温度准确性是PCR仪的重要性能指标。如果仪器温度准确性差，样品槽的实际温度不能达到设定温度，那就无法获得预期的扩增结果，即要么扩增不出来，要么产生非特异性扩增甚至是错误扩增。 温度均一性是获得稳定扩增的保障。若PCR仪的温度均一性差，在出现不同扩增结果时就无法判断是样品本身不同造成还是仪器性能不好所导致。 升降温速率不仅直接影响PCR实验用时，进而影响工作效率，还会影响扩增产物的特异性。升降温速率越快，特异性越好。 PCR仪梯度温度功能对于反应条件的优化(尤其是退火温度的优化)有很大帮助。对于新开展的实验，通过温度梯度功能快速获得最佳退火温度。 样品槽材质影响温控性能 PCR仪样品槽的材质，会影响上述这几个温控方面性能。现在大多数PCR仪采用的是铝合金材质样品槽，高端PCR仪则采用热导性能更好的银质样品槽。 光学检测系统决定结果好坏 对于荧光定量PCR仪来说，光学检测系统的好坏对检测结果会产生很大影响。光学检测系统主要包含激发光源、检测器、信号采集方式、检测通道数量等方面。 激发光源需考虑光谱范围和光强。虽然现在新一代产品的激发光源大多都是LED灯，但单色LED灯和复合光白色LED灯，在激发效果上还是各有优劣。最好能利用各自的优势形成既宽又强的光照激发效果。 检测器主要考察的是检测灵敏度。检测器灵敏度当然是越高越好，灵敏度越高，则可以检测到更低的信号强度，也就是说可以检测到更低的样品浓度。应用在qPCR仪上的检测器主要有PMT和CCD，光电倍增管PMT的检测灵敏度要高于CCD。 每个公司的产品都有自己独特的信号采集方式，有些产品会存在信号光程差的问题，必须额外增加校正染料，比较麻烦。 检测通道数量的多少，将决定该仪器最多能做几重的荧光检测。不同应用领域对于检测通道的多少要求不同，比如做基因表达分析的用户只需一个检测通道就够了，而像新冠病毒检测通常都需要三重或四重检测，这对于仪器的配置就会有不同的要求。 除了上述的温控和光学检测系统外，样品通量、样品槽的多样性、热盖的防蒸发效果、运行时的噪音水平、平台对试剂耗材的适用性、操作界面的友好性等，也是考量一台PCR仪好坏的方面。此外，由于PCR仪是一个使用频率非常高的仪器，所以仪器的耐用性和售后服务也是用户关心的问题。 今年新冠疫情的暴发，人们对于自动化工作平台的需求变得更加迫切和强烈。自动化PCR检测平台对于样品多而人手有限的的政府检测部门、医院、生物制药企业以及一些大型实验室中心平台来说必不可少。 当前已有越来越多的个人实验室在积极搭建自动化系统，可以预见未来几年将迎来全自动检测平台的快速增长。 文章来源：仪器信息网，版权归原平台所有 |
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