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杨剑，许红霞 第三军医大学第三附属医院 陆军军医大学附属大坪医院 细胞生长受到各种营养环境与生长因子的精准调控。蛋白质是细胞内含量最多的大分子物质，氨基酸作为代谢底物参与了细胞蛋白质的合成等重要生理过程。同时，氨基酸作为重要信号分子对机体多种病理生理学过程的调控也愈加受到关注。近年来，营养感应及其病理生理学意义逐渐受到重视。由于氨基酸在细胞生长中发挥的核心作用，氨基酸感应显得尤为重要。mTORC1作为氨基酸的核心感应信号尤其受到关注，细胞内氨基酸的精准感受对于mTORC1功能的正常发挥至关重要。研究发现，细胞内多种氨基酸感应器，如氨基酸转运体、味觉受体、GCN等多种转运体/受体/分子，能够介导氨基酸信号，进而调节mTORC1活性，在氨基酸感应过程中发挥重要作用。更为重要的是，mTORC1对氨基酸感应的失调在恶性肿瘤细胞增殖、转移等方面发挥了关键角色。越来越多证据表明，多种氨基酸感应器及其对mTORC1的调节均可能作为恶性肿瘤治疗的潜在靶点，这为探明肿瘤发生、发展机制，寻找新的防治策略提供新的思路。本文拟就mTORC1在氨基酸感应中的作用及其在恶性肿瘤发生、发展中的角色进行综述。 通讯作者：杨剑（yangjianac@163.com） 原文参见：肿瘤代谢与营养. 2017;4(2):149-154. 1 mTORC1概述 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是高度保守的非典型丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶（PIKK）家族。mTOR通过感受细胞内外各类信号刺激如营养因素、能量刺激、各类生长因子等，进而在细胞生长、增殖、存活、自噬等过程中发挥重要作用【1】。mTOR在细胞内通过与其他分子形成复合物发挥生物效应，其主要形成两种复合物：mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）。目前研究多集中于mTORC1，它由mTORC（核心蛋白）、支架蛋白RAPTOR（mTOR的调节相关蛋白）、2个内源性激酶抑制因子DEPTOR和PRAS40（AKT1S1）、以及mLST 8（GβL）等部分组成【2】，见图1。现有研究表明mTORC1可以通过整合至少4种生长调节方式（营养因素、生长因子信号、细胞能量状态以及细胞压力水平）调节细胞增殖、代谢与存活反应。 图1 mTORC1介导的氨基酸感应和生长因子信号示意图 mTORC1控制细胞增殖的常见途径为直接磷酸化两类下游蛋白翻译调节因子，即核糖体S6激酶1（S6K1）和4E结合蛋白1（4E-BP1）。mTORC1依赖的S6K1的T389位点磷酸化激活其酶活性，从而调节下游涉及mRNA成熟和蛋白翻译的底物。同时，mTORC1对4E-BP1多位点的磷酸化则降低其与翻译起始因子eIF4E的亲和性，促使蛋白质翻译的顺利进行【3】。另一方面，对mTORC1进行调节的，主要也是一种Ras家族的小GTP酶Rheb，其通过促进mTORC1激酶活性，从而引发下游生物学效应。同时，Rheb也被TSC复合物负性调控，TSC1/TSC2复合物作为Rheb的GTP酶活化蛋白（GAP），使Rheb从激活的GTP结合状态转变为失活的GDP结合状态，从而降低mTORC1活性【4】。大量胞内外物质或信号如生长因子、能量水平等，均通过调节TSC复合物活性进而调控mTORC1介导的病理生理学效应。近年研究证实，mTORC1除了在上述物质或信号介导的效应中发挥作用外，其在氨基酸感应中也扮演了关键角色【5】。 2 mTORC1与氨基酸感应 蛋白质是细胞内含量最多的大分子物质，氨基酸作为代谢底物参与了细胞蛋白质的合成等重要生理过程。同时，氨基酸作为重要信号分子对机体多种病理生理学过程的调控也愈加受到关注。细胞需要感应细胞内外的氨基酸，继而对其结合和利用，例如，在氨基酸缺乏条件下，氨基酸则将被重新利用，并被分配给营养缺乏环境下需要的特殊蛋白的合成；在饥饿状态或低血糖状态下，氨基酸也被异化为其他能量物质的产生，例如葡萄糖和酮体。因此，氨基酸的精准感应对于蛋白质合成、食物摄入的有效控制以及其他多种生理效应的调节都具有重要意义。 研究发现mTORC1在氨基酸感应过程中发挥了核心作用。细胞内氨基酸的精准感受对于mTORC1功能的正常发挥至关重要。细胞培养基中的氨基酸缺失能够显著抑制细胞中S6K活化和4E-BP1磷酸化，而且，后者的改变不能被生长因子刺激所代偿，使得两者对所有激活剂都不敏感；然而，重新加入氨基酸混合物后，S6K和4E-BP1对于胰岛素的磷酸化和反应性状态立刻得到恢复，提示氨基酸感应在mTORC1激活中的核心地位【6】。亮氨酸是目前研究最多的mTORC1活化相关氨基酸，谷氨酰胺和精氨酸等也在mTORC1激活中发挥了重要作用，而且mTORC1对上述氨基酸的感应机制是不同的【7,8】。除此之外，上述氨基酸还可以通过联合作用，对mTORC1活性发挥协同调节效应，如谷氨酰胺与亮氨酸协同作用，通过促进谷氨酰胺分解以及α-酮戊二酸产生，进而激活mTORC1【9】。 RAS相关的小G蛋白亚型RagGTP酶在mTORC1对氨基酸的感应中发挥了关键作用。4个Rag蛋白两两组合为异二聚体（RagA/B与RagC/D），与mTORC1中的RAPTOR结合，促使mTORC1转位到溶酶体，从而导致mTORC1活化【10】。Rag蛋白与核苷酸的结合状态决定了其活性程度，只有当RagA/B结合GTP以及RagC/D结合GDP，形成的二聚体才是活性状态。氨基酸水平则能够影响RagGTP酶与核苷酸的结合程度，后者对于RagGTP酶与RAPTOR的结合具有至关重要的作用【11】。氨基酸饥饿的情况下，细胞里会累积RagA/B-RagC/D的异源二聚体，这类二聚体则不能结合mTORC1，见图1。 氨基酸感应的主要部位是在溶酶体，氨基酸必须在溶酶体中累积才可启动其感应信号，其中Rag调节子介导的mTORC1溶酶体膜移位是mTORC1对氨基酸感应的关键事件【10】。利用药物破坏溶酶体膜后，引起溶酶体内的氨基酸无法储存，将抑制氨基酸依赖的mTORC1募集；外源性加入氨基酸后则将增加溶酶体中的氨基酸积累，这也确证了溶酶体在氨基酸感应中的重要性【12】。近年研究发现，除了溶酶体外，高尔基体、细胞膜等均可以产生氨基酸感应，继而启动mTORC1活化，从而发挥各自的生理学作用【13,14】。 3 多种氨基酸感应器介导的对mTORC1的调节效应 研究发现细胞内多种氨基酸感应器，如氨基酸转运体、味觉受体、GCN等多种转运体/受体/分子，能够介导氨基酸信号，进而调节mTORC1活性，在氨基酸感应过程中发挥重要作用。 3.1 氨基酸转运体 氨基酸转运体负责细胞内外的氨基酸交换，这意味着负责亮氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等氨基酸转运的转运体可能在mTORC1调节中发挥重要作用。以SLC38A9为例，SLC38A9是一种溶酶体跨膜蛋白，是溶酶体中Rag-Ragulator复合体的重要组成部分，以氨基酸敏感以及核苷酸结合依赖方式与RagGTP酶相互作用，进而影响mTORC1活性【15,16】。增强SLC38A9功能可以提高细胞对氨基酸缺失的抵抗效应；相反，降低SLC38A9表达则削弱氨基酸诱导的mTORC1活化【17】。进一步研究发现，SLC38A9表达下降特异性降低了精氨酸诱导的mTORC1活化，提示SLC38A9作为精氨酸感应器在mTORC1信号调节中的重要作用【16】。除了SLC38A9外，还有多种氨基酸转运体在氨基酸感应和调节mTORC1活性中发挥了重要功能，例如：定位于晚期核内体和溶酶体（LEL）的PAT1通过与RagGTP酶的物理作用，调节氨基酸依赖的mTORC1活化【18】；PAT4（SLC36A4）则在很多细胞的高尔基体中表达良好，其通过与高尔基体的mTORC1及其调节子Rab1A的相互作用，进而调节mTORC1活性【13】；另外还有LAT 1（SLC 7 A5）、SNAT 2（SLC 38 A2）等氨基酸转运体也参与到mTORC1活化的调节中。 3.2 与氨基酸感应相关的G蛋白偶联受体 近年研究发现，多种G蛋白偶联受体（GPCR）与氨基酸感应密切关联，其中最有代表性的是味觉受体（TR）。TR分为2类：T1R和T2R。T1R又分为3种亚型：T1R1、T1R2和T1R3，它们只有形成异二聚体后，才能在味觉感受中发挥作用。其中，鲜味受体（T1R1＋T1R3）在啮齿动物中可以广泛感受所有L-氨基酸，但在人体中只能对L-谷氨酸具有很高亲和力，其他的L-氨基酸也可以作为其配体，但是其不能感应D-氨基酸【19】。 T1R1/T1R3可以在广泛的啮齿动物和人的细胞株中对氨基酸进行感应，并将信号传递给mTORC1。如果降低味觉受体表达则可削弱氨基酸对mTORC1的调节能力。干扰味觉受体表达则将改变mTORC1定位、提高谷氨酰胺转运体SLC1A5等多个关键氨基酸转运体的表达以及阻止蛋白翻译启动。在T1R3基因敲除小鼠中，mTORC1活化状态明显降低【14】。近来研究证实，蛋氨酸通过T1R1/T1R3-PLCβ-Ca-ERK1/2通路调节mTORC1活性【20】。此外，钙受体（CaR）、GPR93等GPCR也在氨基酸感应中发挥了重要作用【21】。 3.3 Sestrin2 Sestrin2是mTORC1路径上的亮氨酸感应器，通过与GATOR2结合，进而释放与GA-TOR2结合的GATOR1，后者使RagB失活，导致mTORC1抑制【22】。亮氨酸则通过与Sestrin2结合，破坏Sestrin2-GATOR2的相互作用，直接导致mTORC1的溶酶体定位与活化【23】。更有意义的是，Sestrin2-mTORC1途径对亮氨酸的感应具有结构基础。晶体结构研究证实Sestrin2有1个亮氨酸结合“口袋”，后者在正确的结构折叠中发挥重要作用。进一步研究发现结构导向的Sestrin2突变，降低了其对亮氨酸的亲和性，从而导致细胞内mTORC1活化所需要的亮氨酸浓度大大升高【24】。 3.4 GCN2 研究证实，GCN2在氨基酸感应中发挥了重要作用。GCN2与未装载氨基酸的tRNA具有高度亲和力。氨基酸缺乏状态下，未装载氨基酸的tRNA显著增加，GCN2与未装载氨基酸的tRNA结合，启动其构象改变，导致GCN2激酶活化，抑制蛋白翻译起始重要激活子eIF2α活性，最终导致蛋白质合成抑制。GCN2基因敲除（GCN2）小鼠研究证实了GCN2在氨基酸感应中的重要性。与正常生长条件相比，母代GCN2小鼠怀孕期间给予亮氨酸、色氨酸或甘氨酸缺陷的饮食显著提高了产前或新生期死亡率，提示GCN2在适应氨基酸缺乏状态中的重要作用【25】。近来研究还发现GCN2可以通过Sestrin2调节mTORC1活性。氨基酸缺失条件下，GCN2通过诱导Sestrin2表达，从而使GCN2维持对mTORC1活性的抑制效应【26】。 4 mTORC1介导的氨基酸感应与肿瘤的关系 研究表明，mTORC1介导的氨基酸感应及其调节在恶性肿瘤细胞增殖、转移等方面发挥了重要作用。首先，细胞内多种氨基酸感应器在恶性肿瘤中具有异常表达，例如LAT 1（SLC7 A5）、LAT 2（SLC7 A8）、LAT 3（SLC43 A1）、LAT 4（SLC43 A2）等LAT在许多肿瘤中的表达均有增强，在通过mTORC1途径促进蛋白翻译和细胞增殖中扮演了关键角色【27】。而且，LAT与其他蛋白组成的复合物在肿瘤中也可能具有异常表达，例如：CD98/LAT1复合体在多种肿瘤中过量表达，其中LAT1转运体活性是该二聚体形成的关键限制步骤【28】。高表达氨基酸转运体还可能与肿瘤结局相关，例如高水平PAT4表达与结直肠癌术后无复发生存期降低密切关联，深入研究则发现PAT4促进HCT116结直肠癌细胞在体外培养和体内移植瘤模型中的增殖；HCT116细胞中，谷氨酰胺和丝氨酸均以PAT4依赖的方式调节mTORC1，而且PAT4在高尔基体中与mTORC1及其调节子Rab1A均有相互作用【13】，提示肿瘤细胞中高表达的氨基酸转运体通过氨基酸感应进而调节mTORC1活性，从而发挥其病理生理学效应。 其次，抑制氨基酸转运体或感应器的表达或活性则可以改变恶性肿瘤细胞的增殖状态，例如：谷氨酰胺摄取与分解在mTORC1营养感应途径中扮演了关键角色，对调节肿瘤细胞增殖及蛋白翻译发挥了重要作用。ASCT 2（SLC 1A5）在谷氨酰胺摄取中发挥了重要作用。有研究在90例原发性三阴乳腺癌患者中发现ASCT2和谷氨酰胺相关基因具有高表达。进一步研究发现，ASCT2抑制剂可以降低人乳腺癌细胞的谷氨酰胺摄取，导致mTORC1信号抑制、阻止细胞增殖和细胞周期进程。不管是稳定还是瞬时转染降低ASCT2表达均可以有效抑制三阴乳腺癌细胞增殖，诱导细胞死亡。而且在移植瘤模型中也发现，ASCT2表达在体内乳腺癌细胞成功移植和生长中发挥了关键作用；低表达ASCT2提示移植瘤小鼠具有较好的生存时间【29】。其他研究也证实，通过ASCT2抑制剂或敲低其表达水平均可降低黑色素瘤细胞或急性髓性白血病细胞的谷氨酰胺转运，导致mTORC1信号抑制，从而引起细胞增殖降低，诱导细胞凋亡，提示ASCT2介导的谷氨酰胺转运是上述肿瘤治疗的重要潜在靶点【30,31】。另外，降低或抑制其他氨基酸转运体如LAT等，也可通过抑制亮氨酸摄取，导致mTORC1活性降低，细胞周期蛋白表达降低，从而抑制肿瘤细胞增殖【32,33】。 第三，除了氨基酸转运体外，其他氨基酸感应信号的调节在恶性肿瘤发生、发展中也发挥了重要作用。研究发现CaSR在转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞中，通过双重机制调节IL-6分泌。在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，内源性表达的CaSR通过Gαs/PKC、MEK1/2和mTORC1信号途径促进IL-6分泌；另一方面，刺激CaSR后则通过Rab11a依赖的转运途径，通过PI3K/AKT和PKC信号途径抑制IL-6分泌，提示CaSR是转移性乳腺癌细胞的潜在治疗靶点【34】。Rab1A是mTORC1感应氨基酸信号的调节子，异常氨基酸信号通过Rab1A依赖的mTORC1活化，促进肝癌细胞增殖和转移【35】。Rab1A过量表达将促进mTORC1信号以及以氨基酸依赖和mTORC1依赖的致癌生长方式。相反，Rab1A敲低则可降低Rab1A过量表达肿瘤细胞的增殖水平。结直肠具有mTORC1信号增强、肿瘤侵袭增加等特征，而且Rab1A在结直肠癌中也是过量表达。有研究明确提出，Rab1A是mTORC1感应氨基酸信号的调节子，活跃的氨基酸信号将通过Rab1促进肿瘤形成【36】。另外，天冬酰胺作为重要的氨基酸交换因子，是肿瘤细胞氨基酸稳态、合成代谢与增殖的重要调节子。细胞内天冬酰胺水平可以感应氨基酸（特别是丝氨酸、精氨酸和组氨酸）的摄取水平，并调节mTORC1活性与蛋白合成。研究证实，维持细胞内天冬酰胺水平是肿瘤细胞增殖所必需的【37】。 第四，研究发现，对氨基酸感应的调节可能影响抗瘤药物效应。例如，体外细胞实验和体内移植瘤模型研究均证实亮氨酸缺乏饮食和自噬抑制剂联合作用后，可以联合抑制黑色素瘤的恶性增殖，启动肿瘤细胞的广泛凋亡【38】。研究发现，高剂量支链氨基酸（BCAA）可以激活mTORC1，后者导致肝癌干细胞减少以及更低致瘤性。更有意义的是，BCAA不但抑制肝癌干细胞，还可以提高氟尿嘧啶的抗瘤敏感性。相对单一氟尿嘧啶作用，氟尿嘧啶和BCAA联合作用在体内移植瘤模型中具有更好抗瘤效应，提示BCAA可能通过mTORC1途径降低肝癌干细胞数量，从而提高化疗敏感性【39】。 5 小结 氨基酸作为重要信号分子参与多种病理生理学过程的调控作用愈加受到重视。其中，mTORC 1作为氨基酸的核心感应信号尤其受到关注，细胞内氨基酸的精准感受对于mTORC 1功能的发挥至关重要。氨基酸转运体、味觉受体等多种氨基酸感应器在氨基酸感应以及mTORC 1活性调节中发挥了重要作用。更为重要的是，mTORC 1的氨基酸感应及其调节在恶性肿瘤细胞增殖、转移等方面发挥了关键角色。越来越多证据表明，多种氨基酸感应器及其对mTORC 1的调节均可能作为恶性肿瘤治疗的潜在靶点，这为探明肿瘤发生、发展机制，寻找新的防治策略提供新的思路。 参考文献
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