|
一、引言 在过去的二十年中，生物催化剂在有机化学领域中的应用发展非常迅速，生物合成和生物转化已成为医药、化学、生物等领域中备受关注的理念和越来越广泛应用的技术手段。在对于数据库中“生物催化”关键词的搜索后发现，在Elsevier中，已超过2000多篇文献，而在SciFinder中，已有超过5000篇文献报道。 对于生物催化反应，人们常常会有以下偏见：酶是不稳定的（可采取一定的保护措施，有的酶可耐高温）、酶价格昂贵（部分酶价格昂贵，但产业化后价格便宜或经固定化实现循环使用）等。虽然生物催化反应存在以下劣势，如天然的酶只能形成一种对映异构体、酶在水中才能表现出最高的催化活性、酶受制于其天然辅因子（如NADP）等。但其的优势明显，如酶高效的催化剂（具有高选择性：化学选择性、区域选性和非对映体选择性、对映体选择性）、酶的反应条件温和、酶可催化多种类型的反应（水解反应、氧化还原反应、加成-消除反应等） 二、手性醇的合成 手性醇作为药物、精细化学品和农用化学品中重要的结构单元。同时，在制药工业中，该结构作为多种API的关键中间体。而通过生物催化，可在温和的条件下，不使用金属催化剂，即可获得目标手性醇产物。其中，脂肪酶的动力学拆分或KRED的不对称合成，作为制备手性醇最常用的酶促方法。使用KRED时，需使用化学计量的昂贵辅因子NADH或NADPH，但在工业规模上使用异丙醇作为氢化物供体，即可简单地进行NADH的有效回收，而无需第二种酶， NADPH回收通常基于使用葡萄糖脱氢酶（GDH）作为共同的底物。 2.1 KREDs合成手性醇 Dulox alcohol (S)-5是抗抑郁药度洛西汀（Duloxetine）的关键前体。巴斯夫路线利用了来自短乳杆菌的强大KREDs LbADH和固氮弧菌属物种EBN1（aromatoleumaromaticum ebn1），将氯代酮3还高度选择性原为 (S)-4。同时，一种改进的酶，既快速又稳定，实现2-丁醇或异丙醇用于NADH的再循环。随后，经胺化(S)-4，得到(S)-5。若从更稳定的酮6开始，使用来自球形假单胞菌的KRED RtSCR9在1 M浓度和近乎完美的对映选择性下实现。该途径的主要缺点是随后的(S)-7的N-脱甲基过程。使用葡萄糖作为末端还原剂具有较低的原子效率，但会驱动羰基还原反应达到平衡，这比使用异丙醇的优势（即使长时间蒸馏除去丙酮后，异丙醇也难以实现定量转化）。而辅酶GDH是有效的，与KRED相比，其消耗量通常很小。 同时，KREDs也可实现两个立体中心的控制。与先前的路线相比，该方案更为高效，操作简单，选择性极高。 也可使用不同生物催化剂的组合，构建多个手性中心。由辉瑞（Pfizer）科学家设计的γ-secretase抑制剂（a gamma secretase inhibitor）。该过程，使用转氨酶合成手性胺15，使用KRED合成手性醇12，最后经缩合反应，即可获得关键的手性胺13。辉瑞公司的团队，利用可商购的酶进行筛选，并实现公斤规模的合成，并且具有足够的稳定性。 最近，Xu和Zheng课题组报道对KREDs的定向进化，用于合成阿伐他汀（Atorvastatin）前体17。对来自短乳杆菌的KRED（LbCR）进行定向进化以提高热稳定性和活性，可在6h内将(5R)-16（300 g/L）完全还原为(3R,5R)-17。 Chen课题组将KREDs用于二酮19去对称化反应，获得(13R,17S)-20（作为甾体药物的关键手性中间体）。从醇脱氢酶（RasADH）开始，进行了几次定向进化，获得具有优异选择性的RasADH-F12突变体。可在6小时内以1L规模将19（20 g/L）完全转化为(13R,17S)-20。 2.2. 脂肪酶合成手性醇 通过外消旋物的动力学拆分，脂肪酶催化可合成手性醇。但脂肪酶介导的拆分比较繁琐，适用于对醇的区域选择性合成和去对称化过程。如环戊烯二醇21，可选择性酰化以合成前列腺素（prostaglandins）的关键中间体。用市售的脂肪酶QL，可实现最佳的转化率和选择性，并且可在200千克规模上进行。 2.3羟基化合成手性醇 在工业规模上，区域和立体选择性的羟基化反应需求量很大，而单羟基化作用最为突出的酶为细胞色素P450单加氧酶。P450和类似的黄素依赖性单加氧酶对单个羟基化产物显示出非常有用的选择性，这些选择性是常规化学方法无法比拟的。如基于100 L规模的P450-BM3突变体，实现α-异氟尔酮（Isophoron）23可氧化为(R)-4-羟基异氟尔酮24和双氯芬酸（diclofenac）25氧化为其5-羟基产物26。尽管进行了仔细的工艺优化，但生物催化剂的消耗仍然过高，这使该氧化方法无法用于精细化学应用。因此，成功地由单加氧酶催化的未活化烃的羟基化转移的例子仍然很少。 三. 手性胺的合成 手性胺，广泛存在于制药、农业化学中。当前，超过90％的畅销或新批准的小分子药物，均为胺或胺衍生的化合物，其中大多数为手性分子。 3.1 光学活性胺 手性胺最通用的生物催化方法是转氨酶反应，可将羰基底物转化为手性胺。同时，它需要以异丙胺为胺源。此外，也有使用5-磷酸吡哆醛（pyroxidal-5’-phosphate，PLP）的转氨酶来制备对映体纯的化合物。 脂肪酶技术，通过固定在聚酯树脂上的植物伯克氏菌（Burkholderiaplantarii）脂肪酶（BPL）和南极假丝酵母脂肪酶B（CALB），可非常选择性地酰化(R)-对映异构体，如1-苯基乙胺31。随后，当使用甲氧基乙酸酯作为酰化剂时，脂肪酶催化作用大大加快，作为一项突破。对于烷基苄胺，(R)-对映异构体通常以非常高的选择性（E>1000）被酰化，因此在外消旋体转化率为50％时，(S)-胺和(R)-酰胺基本上都可以回收，蒸馏分离后为99％ee。(S)-Moipa，其他取代的氨基醇和大量的手性烷基苄基胺，目前已通过脂肪酶技术，以每年几千吨的规模进行分离。 转氨酶技术，也成功应用于更复杂药物中间体的合成，最著名的例子为默克公司从前手性前体前西格列汀（Sitagliptin）33合成糖尿病药物西格列汀34。从ATA-117（野生型酶的紧密同源物，在底物上没有可检测的活性）开始，经几轮定向进化后，获得最终变体，并使用异丙基胺作为胺源，以92％的收率和99.95％ee获得产物34，浓度为200 g/L。与以前使用Rh-t-Bu-Josiphos催化剂进行高压不对称加氢的化学方法相比，酶促方法总收率高，并减少总浪费以及避免了过渡金属催化剂的使用。
诺华的科学家们探索了合成sacubitril（血管紧张素受体中性溶酶抑制剂超分子复合物LCZ696的两种活性药物成分之一）的新途径。以γ-酮酸35为底物，通过对酶多次进化后，可在高温（58℃）下进行反应，获得dr>99.9:0.1的关键手性中间体36。然而，该酶只能制备手性伯胺化合物。
亚胺还原酶（imine reductases，IRED），通过消耗化学计量NADPH，催化C=N键的还原，获得仲（叔）胺。IRED的合成用途仍然限于环状亚胺、一些在水中稳定的芳族亚胺和杂环亚胺。如辉瑞公司，使用IRED从相应的亚胺38合成(S,S)-Sertraline 39。
3.2裂解酶合成氨基酸 生物催化和均相催化相结合的(S)-2-二氢吲哚羧酸45的一个例子，这是生产血管紧张素1转化酶抑制剂（如吲哚普利Indolapril和培哚普利Perindopril）的关键中间体。使用全细胞具有在大肠杆菌中表达的重组苯丙氨酸氨裂合酶PAL，获得91％收率和99％ee的氨基酸中间体44，随后在铜催化下实现闭环，以95％收率和99％ee获得最终产品45，该工艺用于吨级生产。
四、羰基和手性羧酸衍生物的合成 4.1羰基的合成 醛和酮是作为常见官能团，普遍存在于各类产品中。通常，这些产品通过化学过程生产。但是，生物催化具有高区域选择性的优势，脱氢酶或氧化酶的醇氧化和醛缩酶或裂解酶的C-C键形成，作为有效生产醛和酮的两种主要方法。 Hollmann课题组，报道了一种高效的醇氧化工艺，可合成反式-2-己烯醛50。使用芳醇氧化酶（PeAAOx）和过氧化氢酶在两液相系统中，可在24小时内，实现49的完全转化。这项研究证明了醇氧化酶的高催化效率，并证明了工业生产醛的潜力。
半乳糖氧化酶（GalOx）是一种众所周知的高效醇氧化酶，用O2氧化通常可以非常有选择性合成醛，但是如果醛容易形成水合物，则氧化作用会继续发生形成酸。因此，GalOx已成为大规模氧化合适的氧化酶。如将5-羟甲基糠醛（51）氧化成二甲酰呋喃（52），在较低的酶负荷（2 g/kg产品）下，可以实现几乎定量的产量，此外，52可以进一步氧化为单体2,5-呋喃二羧酸。
醛类生物催化生产存在一个普遍问题，即微生物细胞中天然脱氢酶对还原/氧化的敏感性。最近，Xu课题组报道了将阿魏酸（Ferulic Acid）（53）转化为香草醛（55）的过程。鉴定了两种嗜热酶：来自凝结芽孢杆菌DSM1的酚酸脱羧酶（PAD）和来自嗜热栖热菌的芳香族双加氧酶（ADO）。利用共表达PAD和ADO的大肠杆菌，在50℃和pH 9.5下反应18小时，可将53转化为55。这种生物催化方法具有工业应用潜力，因为该路线符合客户对生物香草醛生产的偏好。
由于高区域选择性，酶特别适合于多元醇和糖的氧化，获得多羟基化的酮和酮糖衍生物。通过一种多元醇脱氢酶（PdPDH）和一种NADH氧化酶，可将半乳糖（56）有效的氧化为D-塔格糖（57）。该反应中使用两个分别含有PdPDH和StNOX的冻干大肠杆菌细胞，并以2 L规模进行生物催化过程，可在15小时内实现56（200 g）到57的转化，收率91％。从而表明，多元醇的生物催化氧化过程作为合成高价值酮糖的有力工具。
除氧化外，醛缩酶或裂解酶还可通过C-C键形成多羟基化的酮和酮糖衍生物。Fessner课题组，使用自大肠杆菌的6-磷酸果糖醛缩酶（FSA），将链烷酮和链烷醛转化为手性β-羟基酮/醛。FSA还可与转酮醇酶和转氨酶组合，用于一锅合成L-核糖，D-塔格糖和L-阿胶糖。如利用大肠杆菌中的FSA（A129S）细胞，可在2小时内将甲醛（58）和二羟基丙酮（59）转化为L-赤藓糖（60）。从而说明，醛缩酶可用于工业酮糖的生产。
4.2 羧酸的合成 羧酸广泛用于化学、食品、材料和制药行业中，而生物催化最适合于工业生产高价值（手性）羧酸。 4.2.1 腈水解 腈水解酶具有很高的活性，无需外部辅因子，通过对腈基的水解，即可获得羧酸化合物。 Wei课题组报道，使用表达Burkholderiacenocepacia J2315的腈水解酶（BCJ2315）的大肠杆菌细胞，可在10L规模24小时内，实现扁桃腈62a至 (R)-63a的转化，产率为93％，ee为99.5％。同时，使用较低的生物催化剂载量（3.9 g CDW/l），从而表明了工业上应用的潜力。(R)-o-氯次膦酸(R)-63b是抗-抗血小板药(S)-氯吡格雷（Clopidogrel）64的关键中间体。然而，由于邻氯取代基的空间位阻，大多数天然腈水解酶在活性和/或对映选择性方面均较差。因此，通过设计相同腈水解酶（BCJ2315）的双突变体（I113M/Y199G），从而表现出具有更高的活性和对映选择性。 通过使用羟腈裂解酶（HNL），可实现由醛制备α-羟基酸，其催化HCN不对称地加成到羰基上。运用蛋白质工程技术，可从杏桃（杏仁）中提取PaHNL， 具有酸性稳定性，而氰醇的外消旋化作用最小。鉴定出PaHNL变体A111G对61b具有很高的活性（409 U/mg），可实现61b在7小时内产生(R)-62b（97％ee），产率为96％，产物/催化剂的比率超过4000。
腈水解酶的另一个很好的例子是3-羟基戊二腈（65）的不对称化水解，得到用于合成阿托伐他汀（Atorvastatin）的中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯（(R)-66）。通过定向进化鉴定具有较高对映选择性的A190G突变体，可实现15小时内产生96％收率和98.5％ee的(R)-66。最近，Zhu和Wu课题组报道了，3-取代的戊二腈去对称化反应，随后Curtius重排和水解制备 (R)-巴氯芬（Baclofen）69。PCC6803及其最佳变体（P194A / I201A / F202V）对67的活性高11倍，对映选择性也极好。(S)-68的制备可在1小时内用表达腈水解酶变体的大肠杆菌，水解67来实现，产率为91％，ee为99％。
4.2.2酯/酰胺水解 酯酶或脂肪酶，水解酯和酰胺，已用于工业生产手性羧酸。当前，许多脂肪酶和酯酶是可商购的，其在有机溶剂中稳定，对（动态）动力学拆分或去对称化具有高对映选择性。因此，它们已被广泛地用于生产手性酸药物的中间体。 为了生产普瑞巴林（Pregabalin），辉瑞公司开发了一种基于脂肪酶催化拆分的工艺，通过商业化的羊毛嗜热霉菌脂肪酶（TLL）对二酯76的水解显示出很高的(S)-对映选择性（E>200），可在24小时内转化率为47.5％，得到(S)-77，该工艺已在实现吨级规模。然而，由于TLL的中等活性，酶的负载仍然太高。最近，Zheng课题组使用了一个TLL（S58L / S83T）突变体，该突变体的活性是野生型TLL的5.5倍。
USB Pharma的一个团队，开发了一种基于水解酶的方法，用于合成(R)-琥珀酸衍生物(R)-79，用于生产布瓦西坦（brivaracetam）。使用来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶C用于外消旋酯78的对映选择性水解。用蛋白酶C在水（4.5L）中水解78（1kg），得到(R)-79（97％ee），收率为42％。但是对于工业应用而言，酶的负载量太高。
五、总结 生物催化剂代表着一类新型的手性催化剂，已广泛的应用于各类有机转化反应中，尤其在制药行业，用于合成API手性药物的关键中间体，已有很多实现了产业化。本文主要对常见的几种酶进行了简单的介绍，如水解酶（用于合成手性羧酸化合物，对多酯选择性水解）、氧化还原酶（合成手性醇化合物）、转胺酶（合成手性胺化合物）等。此外，由于绿色化学理念的不断深入，生物催化一直备受关注。 |
|
|
