高效液相色谱法测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量

昵称37581541 2020-12-10

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本文引用格式：张娟，朱海荣，董茜，等.高效液相色谱法测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量[J].肥料与健康,2020,47(5):67-70.

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基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFF0201801-1）

作者简介：张娟（1976—），女，硕士，教授级高级工程师，主要研究方向为土壤、肥料、农药、化工等产品质量安全监测以及产品研发、检测方法开发和标准科研工作

吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸是常用的植物生长调节剂类农药，同时也是植物体内普遍存在的内源生长素，属吲哚类化合物。我国相关法规规定，含有农药成分的肥料产品必须以农药产品的登记方式进行登记，但由于农药产品登记周期长、费用高，一些不法厂商为了谋取不正当利益，在肥料中违禁添加吲哚-3-乙酸或吲哚丁酸，以突显所谓“肥效”。此种做法对农产品质量安全、生态环境以及人体健康造成潜在威胁。因此，建立准确度高、稳定性好的测定肥料产品中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量的方法非常必要。

测定植物生长调节剂的方法主要有生物鉴定法、免疫检测法、光谱法、色谱法，其中测定吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的主要方法为液相色谱法和液质联用法等。与液质联用法相比，液相色谱法相对经济、快捷，本文建立了同时测定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的高效液相色谱法，可为肥料产品质量安全提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器和自动进样器，色谱工作站，美国Agilent公司；Sigma 3-18K型高速冷冻离心机，德国Sigma公司；电子天平，瑞士Sartorius公司；SIR型漩涡混合器，德国IKA公司。

标准品：吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸，质量分数均为98.0%，美国Stanford Chemicals公司。

混合标准溶液：准确称取0.01 g（精确至0.0001 g）的吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，配制成吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸质量浓度均为1000 mg/L的标准溶液，现用现配。

甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；乙酸为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；试验用水为一级水。

1.2 仪器条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)或分离性能相当的色谱柱；检测器：二极管阵列（PDA）检测器；检测波长：280 nm；流动相：甲醇溶液（A）和体积分数为2.0%的乙酸水溶液（B），高效液相色谱梯度洗脱程序见表1；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：10.0 μL。

1.3 试验方法

称取1.0 g肥料样品（精确至0.0001 g），置于50 mL比色管中，加入20 mL甲醇，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，在高速离心机中以6000 r/min转速离心10 min，全部上清液转移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，过0.22 μm有机相滤膜，待测。

1.4 标准曲线

分别移取一系列吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准溶液（1000 mg/L）于7个容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L的混合标准工作溶液。按照质量浓度由低到高的顺序测定，以吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的质量浓度在1.0～100.0 mg/L范围内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程分别为y=17.46182x-8.31223和y=14.61964x-5.57251，相关系数分别为0.9997和0.9998。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的选择

2.1.1 检测器

PDA检测器灵敏度高、检出限低，对流速和温度波动不敏感，在波长190～490 nm内进行检测可获得相应的色谱图。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸在200～400 nm范围内皆有一定的紫外吸收，因此试验选用PDA检测器。

2.1.2 检测波长

对50 mg/L混合标准工作溶液从190～490 nm进行全波段扫描，经PDA检测器扫描显示，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸在波长210～290 nm内有一定的吸收，但低波长下杂质峰的干扰较大；在280 nm处，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸杂质干扰较小，且皆具有较强的吸收峰。因此，试验选择吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的检测波长为280 nm。

2.2 流动相

试验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇0.1%（体积分数，下同）的甲酸水溶液以及甲醇2.0%的乙酸水溶液等4种体系作为流动相。结果显示：在甲醇-水、乙腈-水、甲醇0.1%的甲酸水溶液等3种体系作为流动相得到的谱图中，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的吸收峰有严重的拖尾现象；而在甲醇2.0%的乙酸水溶液体系中的洗脱效果最好，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的分离度良好且峰形尖锐，满足试验要求。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸标准溶液的典型色谱图见图1。

3 方法的验证

3.1 方法的灵敏度

基于实际空白样品中添加吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸混合标准溶液分析结果，按信噪比为3对应的质量分数计算方法的检出限，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的检出限为5 mg/kg；按信噪比为10对应的质量分数计算方法的定量限，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的定量限为10 mg/kg。

3.2 方法的精密度

对空白加标样品进行精密度试验，样品加标后试样溶液的质量浓度分别为20.00、50.00 mg/L，平行测定6次，计算精密度，结果见表3。试验结果表明，测定结果的相对标准偏差（RSD）小于5%，说明本方法具有良好的重复性和再现性，可满足检测要求。

3.3 回收试验

选取6个实际肥料样品，每个样品平行测定2次，取测定结果的平均值作为本底值。在样品中加入20.00 mg/L混合标准溶液，试验结果扣除本底值，剔除离群值后，分别计算测定结果的平均值和加标回收率，结果见表4。由表4可知，肥料样品中吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的加标回收率为91.46%～104.5%，表明方法的准确度较高。