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Analysis of the Differentially Expressed Genes Induced by Cisplatin Resistance in Oral Squamous Cell Carcinomas and Their Interaction

口腔鳞状细胞癌顺铂耐药性诱导差异表达基因的分析及其相互作用

一、研究背景

        口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种实体瘤，起源于鳞状上皮，全球每年约有40万例新病例，在部分地区发病率较高。尽管手术是OSCC的主要治疗策略，但放化疗仍然是一种有效治疗的方法，尤其是对于晚期肿瘤。但是，由于分子机理尚未阐明而产生的耐药性显著降低了OSCC患者的生存率。MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与特定mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）结合而调节靶基因的表达。miRNA可以同时调节许多靶基因，例如抑癌基因或致癌基因，广泛影响恶性肿瘤的表型，它们可能代表了用于在恶性肿瘤中发现多药耐药性的新的治疗靶标生物标志物。

二、分析流程

三、结果解读

1、亲本和顺铂耐药的OSCC细胞之间基因表达的差异

        作者以OSCC和顺铂耐药为关键词在GEO数据库中检索，下载了GSE111585和GSE115119两个数据集。通过R软件进行的聚类分析（| log FC |> 1，p值<0.01为cut-off）显示，与GSE111585中的亲代OSCC细胞相比，顺铂耐药OSCC细胞中有1,386个上调基因和643个下调基因（图1A），与GSE115119中的亲本OSCC细胞相比，顺铂耐药OSCC细胞中的757个上调基因和625个下调基因（图1B）。Venn图显示：DEGs与癌基因的交集有48个上调的DEGs、与抑癌基因的交集有49个下调的DEGs。（图1C、图1D）

图1：OSCC中顺铂耐药DEGs的鉴定

2、DEGs与miRNA转录调控之间的关系

        作者使用DAVID软件，对得到的DEGs进行功能富集分析（BP、MF和CC）和  KEGG通路分析。

• BP富集表明，上调的DEGs主要富集于细胞增殖调节，炎症反应，脂多糖，响应生长因子刺激的细胞，神经元迁移，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号传导途径以及RNA聚合酶II启动子的转录（图2A）；而下调的DEGs主要富集于对X射线的响应，RNA聚合酶II启动子的负转录调控和DNA损伤响应（图2B）。

• MF富集表明，上调的DEGs主要富集于趋化因子活性，转录因子活性，序列特异性DNA结合，非膜交叉蛋白酪氨酸激酶活性（图2C）；下调的DEGs主要富集于p53结合，转录激活剂活性，序列特异性DNA结合，DNA聚合酶II启动子近端序列特异性结合（图2D）。（原文上调的部分重复了两次“sequence-specific DNA binding”，算是一个不太应该的低级失误）

• CC富集表明，上调的DEGs主要富集于mRNA切割，多腺苷酸化特异性因子复合物，细胞外间隙，早幼粒细胞白血病蛋白质组和转录因子复合物（图2E）；下调的DEGs主要富集于连接复合体，桥粒，纤毛末端，细胞质，核质和质膜（图2F）。

  

图2：DEGs的功能富集分析

• KEGG通路分析提供了DEGs的潜在功能簇，分析表明上调的DEGs富集于疟疾，人类T细胞白血病病毒I型，恶性肿瘤的途径，军团菌感染疾病，TNF信号通路和T细胞中的受体信号通路（图3A），而下调的DEGs则明显富集于癌症的轴突导向和miRNA中（图3B）。

图3：DEGs的KEGG信号通路分析

3、通过DEGs的PPI网络识别关键基因

         为了进一步分析顺铂耐药OSCC细胞中DEGs之间的相关性，作者使用STRING构建可显示DEGs之间密切关系的PPI网络并计算了hub score。高得分表明该基因与其他基因有很强的相关性（图中以暖色显示）。如图4所示，以hub score＞300为cut-off，选择了以下五个基因作为Hub基因：NOTCH1，JUN，CTNNB1，CEBPA和ETS1。

图4：DEGs的PPI网络

4、基于miRNA-靶基因预测的miRNA-mRNA网络的构建

        由于顺铂耐药OSCC细胞中的DEGs与肿瘤相关的miRNA密切相关，因此作者使用miRDB数据库预测在此过程中可能参与关键基因基因转录调控的miRNA。作者还从miRDB数据库中收集了预测分数，而miRNA–mRNA的高分数意味着miRNA在调节靶mRNA方面具有关键作用。在设置cut-off> 80后，作者使用Cytoscape软件构建了miRNA–mRNA网络（图5）。作者发现，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-200b-3p，hsa-miR-429和hsa-miR-139-5p可以同时调节多个关键基因，这可能是此过程中涉及的关键miRNA。而hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-429都属于miR-200家族成员，功能相似：抑制ZEB1 / 2，从而抑制上皮-间质转化（EMT）。

图5：构建miRNA-mRNA网络 红圈代表潜在的可调控多个关键基因的miRNA

5、关键基因的表达模式及生存价值

• 使用Oncomine数据库分析了关键基因表达水平的差异，由于对OSCC的研究有限，只有一项研究表明CTNNB1和ETS1在肿瘤组织中的表达高于正常组织，而NOTCH和JUN没有发现差异。（图6）

图6：关键基因的表达情况

• 作者借助cBioportal进行生存分析，结果表明OSCC患者CTNNB1的低表达表现出更好的OS（总生存期）（图7C），而CEBPA的低表达预示了OSCC患者的OS较差（图7D）。

• 尽管其他关键基因的表达与OSCC患者的OS没有显著相关性（p> 0.05），但是NOTCH1（图7A）和ETS1（图7E）高表达或JUN（图7B）低表达的患者倾向于具有较长寿命。

图7：关键基因的表达与OS的关系

• 除了NOTCH1，在OSCC患者的其他关键基因中均未发现突变，而且NOTCH1中的突变与OSCC患者的OS无显著关联（图8），表明在无关键基因突变的情况下进行调节是OSCC顺铂耐药的主要机制。

  

图8：关键基因突变对OS的影响

小结

        作者基于GEO数据库，使用生物信息学方法获取差异基因，对其进行功能富集分析与KEGG通路分析，并构建PPI网络预测关键基因，发现NOTCH1，JUN，CTNNB1，CEBPA和ETS1是调节OSCC耐药细胞系中顺铂耐药性的关键基因。随后作者借助miRDB预测与关键基因相关的miRNA，发现miR-200家族可能能够通过调节NOTCH1，JUN和ETS1来逆转OSCC细胞的耐药性， 它也可以作为治疗顺铂耐药OSCC患者的潜在靶点。最后，作者在转录层面评估关键基因的预后价值，探究了关键基因突变对OS的影响。