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大家好！今天给大家介绍一篇非肿瘤的的生信文章。本文主要方法包括DEG的功能富集分析、自噬相关DEGs的获取、PPI网络分析和体外qPCR验证。此外，作者还进行了免疫细胞浸润分析和lncRNA-miRNA-mRNA网络构建，并研究了IDD中免疫细胞浸润与ceRNA网络的相关性。
4 基于分型的非肿瘤生信分析 5 单细胞结合普通转录组生信分析 目前最新的机器学习思路是使用100多种机器学习组合进行建模或者筛选关键基因，这种方法在肿瘤中已经发表多篇1区文章，例如 最新1区8+纯生信，结合10种机器学习算法构建模型，换个肿瘤可重复！ 如果这种思路在非肿瘤中使用，势必会给文章提高档次！目前非肿瘤生信发文的门槛较低，有需要的朋友欢迎添加小编微信咨询 摘要 背景：椎间盘退变（IDD）是老年人最常见的健康问题之一，也是下腰痛（LBP）的主要致病因素。越来越多的研究表明IDD与自噬和免疫失调密切相关。因此，本研究的目的是确定IDD中自噬相关的生物标志物和基因调控网络以及潜在的治疗靶点。 方法：从GEO数据库下载数据集GSE176205和GSE167931获得IDD的基因表达谱。随后，进行差异表达基因（DEGs）分析，KEGG分析，GO和基因集富集分析（GSEA），以探讨DEGs的生物学功能。然后将差异表达的自噬相关基因（DE-ARGs）与自噬基因数据库取交集。利用DE-ARGs蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络筛选hub基因。证实了hub基因与免疫浸润的相关性以及hub基因调控网络的构建。最后，使用定量PCR（qPCR）来验证中枢基因在大鼠IDD模型中的相关性。 结果：本研究获得了636个富含自噬途径的DEGs。研究结果显示，30个DE-ARGs中6个枢纽基因（MAPK8、CTSB、PRKCD、SNCA、CAPN1和EGFR）是使用MCODE插件鉴定的。免疫细胞浸润分析显示，IDD中CD8+T细胞和M0巨噬细胞的比例增加，而CD4+记忆T细胞、中性粒细胞、静息树突状细胞、卵泡辅助T细胞和单核细胞的数量则少得多。随后，使用15个长非编码RNA（lncRNA）和21个microRNA构建了竞争性内源性RNA（ceRNA）网络。在qPCR验证中，两个枢纽基因MAPK8和CAPN1与生物信息学分析结果一致。 结论：本研究确定MAPK8和CAPN1是IDD的关键生物标志物。这些关键枢纽基因可能是IDD潜在的治疗靶点。
图 1 研究流程 差异基因识别 将两个高通量测序数据集GSE176205和GSE167931标准化并合并为一个数据集用于本研究。然后在数据分析之前对合并数据集进行批量效应消除（图2A、B）。使用用于R中的差异基因分析的limma包从组合数据集获得总共636个DEG，其包含468个上调的基因和168个下调的基因（图3A、B）。所有DEG见补充表S3。
图 2 GEO数据库预处理。
图 3 与IDD相关的mRNA的差异表达 差异基因的富集分析 为了进一步探究这些筛选出的DEGs潜在的生物学变化，使用DAVID在线数据库进行KEGG和GO富集分析，并导出到R中进行可视化。KEGG结果显示，DEGs主要富集于肌萎缩侧索硬化症、冠状病毒病（COVID-19）、志贺氏菌病、沙门氏菌感染和内质网中的蛋白质加工。前15个KEGG通路大多集中在免疫相关疾病(图4A、B)。GO BP注释结果显示，差异基因主要富集在染色质组织、蛋白质自磷酸化和自噬。前15个GO生物学过程显示DEGs与自噬(图4C、D)密切相关。
图 4 DEGs的功能富集分析。 GSEA富集分析 将基因集h.all.v2022.1.Hs.symbols用于GSEA分析。在排除无统计学显著性的结果后，MIT0TIC_SPINDLE、IL2_STAT5_SIGNALING、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB和UV_RESPONSE_DN在IDD中显著活化（图5），表明这些生物过程可能与IDD密切相关。
图 5 GSEA富集分析 DE-ARG的鉴别 为了进一步探索IDD中的自噬相关基因（ARG），作者将从MsigDB数据库获得的404个ARGs与从人类自噬数据库获得的232个ARGs结合起来，总共获得了547个ARGs。然后将ARGs与DEGs相交，获得30个DE-ARG（图 6A)。以p<0.05为阈值在DAVID数据库中对DE-ARGs进行KEGG和GO分析，并在R中可视化富集结果（图 6B、C)。
图 6 自噬相关差异表达基因的鉴定。 PPI的构建及hub基因的鉴定 使用中等置信度的STRING数据库探索了30个DE-ARGs之间的相互作用，并获得了包含30个节点和24条边的PPI网络（图7A）。使用Cytoscape的内部分析插件MCODE，过滤DE-ARGs的PPI网络以获得具有最高聚类分数的子网络用于可视化（图 7B）。如图所示，作者假设MAPK 8、CTSB、PRKCD、SNCA、CAPN 1和EGFR是hub基因。组合数据集中这六个hub基因的热图和3D PCA图揭示对照组与IDD组显著不同（图7 C、D）。在GSE176205和GSE167931数据集中，六个hub基因的AUC值高于0.75，表明六个hub基因具有优异的诊断性能，并且可以用作IDD诊断中有希望的生物标志物（图7 E）。
图 7 DE-ARGs中 hub基因的筛选。。 IDD免疫细胞浸润的变化 使用CIBERSORT算法评估了正常和IDD样本中浸润免疫细胞亚型的相对丰度。条形图和热图显示每个样品中多种免疫细胞亚型的浸润（图8A）。小提琴图显示两个样本组之间免疫细胞百分比的差异（图8B）。与正常样品相比，IDD样品显示CD8+T细胞和M0巨噬细胞的浸润增加，而CD4记忆静息T细胞、中性粒细胞、静息树突状细胞、滤泡辅助T细胞和单核细胞显示浸润减少（图8C）。最后，热图揭示了hub基因与免疫细胞浸润之间的相关性（图8D）。如图所示，hub基因的表达与跨亚型的免疫细胞浸润显著相关。IDD样品中减少的CD4记忆静息T细胞与高表达的CAPN1和EGFR负相关，与MAPK8、CTSB和PRKCD表达正相关。
图 8 IDD和对照组之间细胞浸润。 Hub基因潜在mRNA-miRNA-lncRNA（ceRNA）网络 为了揭示这六个hub基因的潜在转录后调控机制，作者筛选了IDD发展过程中差异表达的miRNA和lncRNA，并构建了一个ceRNA网络。GSE167199的DE-miRNA和DE-lncRNA在R软件中使用limma包进行鉴定和筛选，其中|log2FC|>1和p< 0.05设定为显著性阈值。鉴定了总共139种DE-lncRNA和65种DE-miRNA（图9A、B）。随后，使用ENCORI在线数据库预测六个hub基因靶向的miRNA，并与DE-miRNA相交以获得mRNA-miRNA结合对。此外，使用mirNet数据库预测上一步骤中筛选的DE-miRNA的可能结合lncRNA，并将预测的lncRNA与DE-lncRNA交叉以构建miRNA-lncRNA结合对。然后整合mRNA-miRNA和miRNA-lncRNA结合对以构建六个中枢基因的ceRNA网络（图9 C、D）。
图 9 构建6个hub基因的ceRNA网络。 Hub基因的验证 NP组织切片的X射线、MRI和H&E染色显示IDD大鼠模型中NP严重受损（图 10A)。RT-qPCR分析显示，IDD模型中聚集蛋白聚糖（aggrecan）和Ⅱ型胶原蛋白（COL-2）的mRNA水平降低（图 10B)。作者检查了IDD模型中枢纽基因的mRNA表达。结果显示，与其他hub基因不同，只有CAPN1和MAPK8的表达与DEGs分析结果一致（图 10C)。此外，作者还使用p< 0.05作为筛选阈值（图10D)。因此，CAPN1和MAPK8被验证为IDD进展中的最终hub基因。
图 10 hub基因在正常大鼠和IDD模型中的表达水平。 结论 综上所述，在本研究中，作者利用生物信息学方法分析了IDD的DEGs，包括DEG的功能富集分析、自噬相关DEGs的获取、PPI网络分析和体外qPCR验证。此外，作者还进行了免疫细胞浸润分析和lncRNA-miRNA-mRNA网络构建，并研究了IDD中免疫细胞浸润与ceRNA网络的相关性。在动物实验中，他们在mRNA水平上验证了两个hub基因（MAPK8和CAPN1）的表达，这与生物信息学分析的结果一致。本研究为IDD的发病机制提供了新的见解，并有助于确定IDD发病机制中新的潜在治疗靶点。 |
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