 一、研究背景CTLA-4是第一个靶向癌症治疗的免疫检查点，也是批准抗CTLA-4抗体，Ipilimumab后，FDA确认的第一个靶点。然而与抗PD-1抗体相比，抗CTLA-4抗体的临床有效率更低，免疫不良反应(irAE)更强。因此，CTLA-4靶向的癌症免疫治疗停滞不前。相比于阻断CTLA-4和同源靶点CD80，CD86的反应，抗CTLA-4抗体通过选择性减少肿瘤微环境的调节性T细胞(Treg)来达到疗效。因此，研究者发明了免疫不良反应降低、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性/吞噬作用(ADCC/ADCP)增强的新一代抗CTLA-4抗体。 二、分析流程三、结果解读1.选择性荷瘤小鼠通过pH敏感的抗CTLA-4抗体选择性减少瘤内Treg以往研究表明，包括Ipilimumab在内的抗CTLA-4抗体选择性减少小鼠肿瘤微环境中的Treg，而不减少脾脏中的Treg。而当使用增强ADCC的抗体时，一些表达CTLA-4的效应T细胞是否被抗CTLA-4抗体减少尚不清楚。作者发现，pH敏感的抗CTLA-4抗体在ADCC和肿瘤排斥中更有效。从而引出了增强ADCC活性是否会损害抗体选择性的问题。 作者首先用流式分析比较了小鼠T细胞亚群表面的CTLA4水平，发现在肿瘤浸润的CD4 T细胞中，基本上所有Foxp3+细胞都表达高水平的细胞表面CTLA-4（图1a）。虽然大部分Foxp3-CD4 T细胞表面CTLA-4呈阴性，但仍可识别到表达CTLA-4的细胞，因而成为抗CTLA-4抗体的潜在靶点（图1b）。而脾脏Treg表面表达很低水平的CTLA-4，非Treg的CD4T细胞表明不表达CTLA-4。（图1c,d） 为了检测抗CTLA-4抗体的选择性，作者分别用pH敏感的HL32和pH不敏感的Ipilimumab处理荷瘤小鼠。24h内即观察到HL32处理的小鼠Treg显著减少，与先前报道一致。为了进一步确定选择性，作者基于图1b将肿瘤浸润CD4和CD8T细胞分成4个亚群（CD4+CTLA4+Foxp3+，CD4+CTLA4−Foxp3+，CD4+CTLA4+Foxp3−和CD8+CTLA4+Foxp3−），并比较它们对HL-32和Ipilimumab的反应性。结果表明，HL32仅减少CD4+CTLA4+Foxp3+亚群。值得注意的是，CD4+CTLA4+Foxp3-细胞没有减少，即使其中一部分细胞表达CTLA-4（图1c）。而Ipilimumab在24h内不减少任何亚群。抗体处理96h后，Ipilimumab和HL32处理小鼠中均观察到肿瘤浸润Treg的减少。同样，减少仅限于CD4+CTLA4+Foxp3+亚群。且在脾脏T细胞的任何亚群都观察不到减少（图1de）。 上述结果共同表明，肿瘤浸润CD4+CTLA4+Foxp3+细胞的选择性减少与高水平表达的细胞表面CTLA-4相关。 2.人类肿瘤对抗CTLA-4免疫治疗反应性的排序方法第一步：挖掘CTLA-4反应数据，鉴别与抗CTLA-4抗体Ipilimumab临床反应性相关的4个特征。并将ADCC作为第5个特征，用于新一代ADCC依赖的抗CTLA-4抗体的治疗反应性排序。 第二步：分析22类肿瘤中7279个独立样本的TCGA RNAseq和DNAseq数据，分析构成上述5个特征的成分。基于这些成分的中位值排序，每个特征的排序是由1-3个成分的平均排序得来。最后，作者对这5种特征进行同等的加权处理，得到22种癌症的综合排序。 3.特征1：基于CTLA4表达的人类癌症排序作者首先挖掘了抗CTLA-4治疗反应数据库，识别与应答显著相关的基因。比较基因的转录水平，发现169个基因显著上调，178个基因下调。且通路分析表明上调基因与免疫应答显著相关，下调基因与免疫应答不相关。在上调基因中，CTLA-4转录水平在Ipilimumab应答样本中显著升高。相比之下，CTLA-4的配体CD80和CD86与应答与否无显著关联。（图2b） 上述数据共同表明，Treg选择性减少的一个关键因素是CTLA-4的表达水平。因此，作者将样本的CTLA4表达水平作为预测免疫治疗反应性的一个关键因子。利用癌症样本的RNAseq数据，得到CTLA4表达值的排序（见表1）。大部分癌症中CTLA4转录水平高。其中，非小细胞肺腺癌(LUAD)水平最高，其次是黑素瘤转移灶、基底型乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。低级别脑胶质瘤(LGG)CTLA4表达水平最低。 4.特性2：肿瘤组织抗CTLA-4抗体ADCC潜能的排序据报道，抗CTLA-4治疗与等位基因FCGR3A158F有关，因为该等位基因编码一种增强IgG Fc结合的蛋白，从而提高ADCC/ADCP活性。挖掘数据库中的158F等位基因频率发现，大多数癌症类型具有相似的158F等位基因频率。（图3a）肿瘤中FCGR3A高表达要么是因为表达FCGR3A的细胞丰富，要么是因为单个细胞中表达水平较高，而两者均与ADCC/ADCP活性相关。因此作者又评估了FCGR3A的转录水平（图3b）。 CTLA-4靶向治疗会减少肿瘤特异性Treg，新一代抗CTLA-4疗法的效应该更明显，可能显著消耗Treg。因此作者使用CIBERSORT估计了肿瘤浸润Treg的含量，发现大多数癌症类型中Treg含量较高（图3c）。 由于上述3个属性对ADCC的相对重要性不明确，所以作者对FCGR3A158V等位基因频率、FCGR3A表达和Treg含量进行加权处理，生成ADCC评分（表1）。结果表明，膀胱癌(BLCA)ADCC排名最高，STAD ADCC排名最低。 5.特性3：抗CTLA-4治疗反应性的转录组特征为了确定临床反应的转录组特征，作者使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)将癌症转录组数据中的免疫特征评分与6个免疫基因集进行比较。（图4a）结果表明，在应答抗CTLA-4抗体的预处理样本中，三种免疫特征（“适应性免疫应答的正向调节”、“淋巴细胞激活”和“效应性CD8 T细胞标志物”）显著上调。作者比较了22类癌症中的这3个特征并排序（表1）。其中，适应性T细胞应答中特征信号最强的是LUAD、HNSC和肾透明细胞癌(KIRC)，而GBM和LGG信号最低（图4b）。 6.特性4：基于免疫浸润细胞比例的排序为了研究某些特定的白细胞亚群是否会影响抗CTLA-4治疗应答率，作者用CIBERSORT算法评估了肿瘤微环境中每个白细胞亚群的比例。其中，CD8 T细胞，巨噬细胞M1与抗CTLA-4反应正相关；静息CD4记忆T细胞与之负相关（图5）。其他细胞类型，包括活化CD4记忆细胞、巨噬细胞M0和M2与Ipilimumab单抗的反应无显著相关。于是作者根据CD8 T细胞、巨噬细胞M1、静息CD4记忆T细胞的含量对22种癌症类型进行排序（图5b）。加权排序见表1。结果表明，转移性(SKCM-TM)和原发性(SKCM-TP)黑素瘤对Ipilimumab反应最好，而肾脏肾乳头状细胞癌(KIRP)的反应最差。
7.特性5：肿瘤突变负荷和新抗原计数肿瘤突变负荷会影响Ipilimumab的治疗反应。一致的是，抗CTLA-4应答样本的非沉默突变率和新抗原负荷显著高于不应答样本，而突变率的增加又导致潜在新肿瘤抗原池的扩大，与Ipilimumab的反应相关。因此，作者根据突变负荷和新抗原对22种癌症类型进行了排序。其中SKCM-TM、LUAD和LUSC排在前3位。 8.癌症反应性排序的一个综合指标分析了抗CTLA-4治疗反应性的5个特性后，作者就能够根据个体属性对22种主要人类癌症进行排序（表1）。对每个属性进行加权处理后，可以生成一个癌症反应性的综合指数。 综合分析，SKCM-TP、LUAD、HNSC和LUSC是抗CTLA -4治疗反应最强的4类癌症。而它们对mAb反应强是不同原因所致：SKCM-TM、LUSC和LUAD突变/新抗原负荷排名较高；SKCM-TM、LUAD和HNSC的CTLA4表达水平较高；SKCM-TM在免疫细胞浸润模式排第一；LUAD和HNSC在基因特征排名较高。强调了结合不同属性对抗CTLA-4 mAb潜在反应性排序的重要性。 9.在人类肺癌组织中预测Treg删除的选择性作者根据上述分析预测到NSCLC、LUAD、LUSC对新一代抗体反应很好，于是接下来作者选取NSCLC组织进一步深入分析了人类肿瘤浸润T细胞，以预测抗CTLA-4抗体诱导Treg减少的选择性。 首先，作者分析了NSCLC的scRNAseq数据集，绘制了CTLA4在16个T细胞亚群中的表达情况。结果表明，CTLA4转录产物主要集中在其中4个亚群：CD4 T细胞的C9、C8、C7和CD8 T细胞的C6（图6ab）。接下来，作者用小提琴图展示了这4个亚群中单个细胞的CTLA-4表达水平（图6c），其中活化Treg CD4-C9的CTLA-4表达水平最高，最可能成为抗CTLA-4抗体的靶点。而耗竭CD4 T细胞CD4-C7不表达FOXP3，CTLA-4水平较低但仍显著。另外两个亚群CTLA-4表达水平远低于CD4-C9，不太可能对抗体易感。 根据图1的荷瘤小鼠模型的结果，FOXP3-CD4细胞尽管显著表达CTLA-4，但其不受CTLA-4抗体的影响而减少。外推到人类癌症，抗CTLA-4抗体的选择性减少作用可能仅限于活化的Treg。已有研究表明癌症中活化的Treg表达CCR8标记，于是作者进一步分析CTLA-4+细胞表面CCR8标记，发现绝大多数CTLA-4+细胞表达CCR8（图6hi）。作者分析先前的数据也发现肺癌组织中CCR8选择性表达于活化的Treg上，而活化Treg CD4-CD9在四个亚群中CTLA-4表达水平最高。因此，增强ADCC的抗CTLA-4抗体很可能是选择性减少NSCLC中活化的Treg。 小结 本篇文章中，作者首先基于荷瘤小鼠细胞表面CTLA-4表达和表面分子标志将T细胞分为不同亚群，然后用pH敏感和pH不敏感的抗CTLA-4抗体处理荷瘤小鼠，分析发现新一代抗体选择性减少高表达CTLA-4的细胞。 然后作者分析了TCGA数据库中22个癌症类型，7279个独立肿瘤样本的RNAseq和基因组数据，从转录特征、免疫特征、免疫细胞浸润等方面鉴定出抗CTLA-4应答的5个特征，每个特征又包含1-3个组分，加权处理后获得一个综合的治疗反应性排序。分析预测表明，转移性黑素瘤应答性最好，非小细胞肺癌(NSCLC)对抗CTLA-4抗体高度应答。于是作者进一步通过分析人类NSCLC浸润T细胞的流式细胞术和单细胞RNAseq分析结果，发现增强ADCC的抗CTLA-4抗体对活化的Treg具有高度选择性。 |
|
|
