 一、 研究背景许多体细胞突变已被证实可以预测肺腺癌(LUAD)的免疫检查点封锁(ICB)治疗疗效，但因不同研究的测试平台，临界值定义等存在差异，所以需要开发更有效的临床预测工具来确定最有可能从ICB治疗中获得疗效的患者。近年来，深度神经网络(DNNs)作为一种实现人工智能的新技术受到人们的关注，不仅可用于智能图像识别任务，还可以从基因表达谱中提取特征，获得与预后相关的生物标志物。 二、 分析流程三、 结果解读1.基于体细胞突变的DNN可以预测免疫疗法的临床效益作者在TensorFlow(基于Python的机器学习框架)中使用了DNNs对训练集（MSKCC，n = 143）和两个验证集（MSKCC，n = 36和VAN ALLEN队列，n = 47）的测序数据分析了体细胞突变。DNN由一个输入层、两个隐藏层、一个丢失层和一个输出层，激活函数RELU，损失函数cross-entropy组成，learning rate和迭代次数分别设置为0.0001和3000。输入层由100个体细胞突变组成，输出层对应治疗效果（DCB和NDB）。DCB定义为完全缓解（CR），部分缓解（PR）或持续≥6个月的稳定疾病（SD）;NDB定义为持续<6个月或进行性疾病（PD）。下表为本篇研究所用到的五个队列，五个队列数据均在cbioportal数据库中获得。
图2.ab显示随着迭代次数增加，准确率逐渐增加和损失值逐渐减小。最后作者确定了23个体细胞突变作为DNN的输入层，两个不同的亚组C1（分别为n = 55、19和15）和C2（分别为n = 88、17和32）与治疗效果（DCB和NDB）显著相关。在DNNs模型中，C1和C2组的23个体细胞突变中TP53，KMT2D，EGFR和STK11突变显著。 接下来的ROC分析进一步评估了不同变量的预测效果，包括TP53，KRAS，STK11和EGFR突变，TMB和C1与C2。其中，C1和C2的预测效果最好，AUC=0.884，Youden指数为0.769(表示诊断试验发现真正的患病和非患病者的总能力)，证实了DNNs在预测免疫反应的能力上显著超过单基因突变和TMB，并在MSKCC队列中得到了验证，VAN ALLEN可能因为样本太小，效果无显著差异（图2.c）。作者接下来还使用了单因素COX分析了4个基因突变，TMB和DNNs与DCB的关系，只有TMB与DNNs与DCB显著相关；还比较DNNs模型和结合了4个基因和TMB(+PD-L1)的多变量模型的预测效果，DNNs模型预测效果均比其他两种模型更好。作者还发现DNNs预测不同的免疫疗法，以及在不同的EGFR突变状态下的预测能力都是稳健的。 图2.d显示训练集和验证集中大多数C1组患者对免疫治疗反应较好(DCB)，C2组患者对免疫治疗反应较差(NDB)。对于接受抗PD-1 / PD-L1治疗的患者，与C2组相比，DNN的C1组表现出更好的OS和PFS，并在验证集中得到了验证（图3）。最后作者纳入其他临床因素和遗传因素进行单变量和多因素COX分析，证实了DNNs模型是抗PD-1 / PD-L1治疗预后的独立预测因子。 2.C1组中有更多的免疫细胞浸润和IFNγ相关基因的表达基于DNNs分析，作者将具有WES和RNAseq数据的TCGA-LUAD队列(n=510)分为两个亚组(C1=176；C2=334)。首先通过确定22种免疫细胞中免疫相关的mRNAs表达水平来研究C1组与TME之间的关联，发现参与炎症反应和IFNγ途径的mRNA在C1组中显著富集（图4.a）。在TCGA-LUAD的免疫相关基因中，CD8A、CD3D和CD4在C1组中显著上调（图4.b），与活化的效应T细胞和IFNγ途径有关的基因，如STAT1、CCL4、CXCL9、CXCL10，TBX21和IFNG也显著上调（图4.ab）。 接着，作者采用CIBERSORT分析了每个肿瘤样本中22种免疫细胞类型的相对丰度(图4.c)，发现C1组表现出更多的肿瘤浸润CD8+CTL。同样地，在C1组中，活化的NK细胞和M1巨噬细胞的数量显著增加，这些细胞可能有助于提高抗肿瘤免疫应答。在C2组中，M2巨噬细胞的数量显著增加，可能与抗PD-1治疗的无效应答有关(图4.d)。 3.DNNs分类与PD-L1表达、免疫表型的相关性作者接下来评估了来自TCGA-LUAD的RNA-Seq表达数据，并研究了C1/C2与PD-L1表达的相关性。免疫检查点的平均mRNA表达如图5.a所示，PD-1、PD-L1、PD-L2、 LAG3、VTCN1、IDO1和TIM3在C1组中富集。C1组的PD-L1mRNA和蛋白(来自TCGA反相蛋白芯片RPPA分析)表达显著增高，利用MSKCC队列中的PD-L1免疫组织化学(IHC)评分，进一步证实了C1组PD-L1的高表达。(图5.b) 为了确定DNNs预测抗PD-1/PD-L1治疗反应的能力，作者使用免疫表型分析来研究免疫表型评分(IPS)与 C1/C2组之间的相关性。免疫表型图(图5.c)显示了TCGA中四种类型(CTLA4_negative+ PD-1_negative，CTLA4_positive + PD-1_negative, CTLA4_negative + PD-1_positive, CTLA4_positive + PD-1_positive)的IPS，IPS即基于肿瘤免疫重要的成份表达情况进行打分，包括MHC分子、免疫调节因子、效应细胞和抑制性细胞。作者发现，在PD-1_neg+CTLA4_neg中， C1组的IPS低于C2组。有趣的是， 在PD-1_neg+CTLA4_pos和CTLA4_pos+PD-1_pos中，C1组IPS显著升高(图5.d)。这些结果表明，C1组患者对 抗PD-1/PD-L1治疗或抗PD-1/PD-L1和抗CTLA4联合治疗均有较好的反应。 接着作者在TCGA-LUAD队列分析了DNNs预测接受肿瘤切除、化疗或放治而没有免疫治疗的的预测能力，C1和C2组的OS和无病生存期(DFS)没有显著差异 (图5.e)。
4.C1和C2组具有显著差异的肿瘤突变负荷和突变谱虽然TMB和DNNs都涉及到体细胞突变，但LUAD患者中的DNNs与TMB的关系尚不清楚。作者对三个独立的队列中的非同义突变与两种DNNs分类(C1：n=75、52和 176；C2：n=108、111和334)进行了比较。与C2组相比，C1组在Broad、TSP和TCGA队列中均表现出更多的非同义突变。作者使用癌症免疫组图谱 Cancer Immunome Atlas(https:///home)预测新抗原的信息，在TCGA队列中发现C1组的新抗原多于C2组，这些均有助于增强C1组患者对抗PD-1/PD-L1治疗的免疫反应(图6.a)。 作者进一步分析了C1组体细胞突变中四个碱基(A、 T、C和G)的突变特征。在颠换transversions(T>A、C>G、C>A和T>G)和转换transitions(A>G和C>T)中，C1 组的转换和颠换都显著高于C2组(图6.b)。作者也研究了这两个队列的突变谱状态，发现C>A颠换频率的增加、C>T转换频率的降低与C1组中的高突变显著相关，这一结果在 TCGA-LUAD队列中得到了进一步的验证(图6.c,d)。最后作者计算了Broad和TCGA队列中每个样本的transversions和transitions(Tv/Ti)比率，并观察到C1组具有较高的Tv/Ti(图6.c,d)，而已知transversions更可能会改变氨基酸序列，从而导致翻译蛋白的突变。
小结 本篇文章基于体细胞突变的深度神经网络分类提供了一种可靠的抗PD-1 / PD-L1治疗预测方法，并通过发现由DNNs得到的两种分类(C1、C2)与TMB，新抗原负荷，PD-L1表达和免疫细胞浸润之间的显著关联，验证了DNN可以用作ICB的预测工具。而且作者开发的DNNs预测模型不需要临界值，与TMB和多种单个突变标志相比，预测结果更稳健，更具有临床可操作性。 |
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