Science Immunology | 靶向抑制肠道菌群特应性T细胞代谢，预防克罗恩病复发

炎症性肠病在发达国家的发病率大约在千分之三，而在发展中国家，随着居住卫生条件的改善，炎症性肠病的发病率也在逐年上升。目前，学界普遍接受通过卫生假说（hygiene hypothesis）理论来解释这一现象，即环境中的微生物对于人体免疫系统的建立与成熟不可或缺。遗传因素以及人体免疫系统对自身肠道菌群的异样性反应是导致炎症性肠病发病的主要原因。一旦发病，炎症性肠病通常会伴随终身，不断复发，导致生活质量的严重下降以及高昂的医疗负担。然而现存的临床治疗手段主要集中于通过抑制非特异性免疫反应来减缓发病症状，并不能有效地预防疾病的复发。

美国阿拉巴马伯明翰大学的Dr. Charles Elson是诊断及治疗炎症性肠病的专家。其实验室多年来致力于发现并解决这一疾病的致病因素以减缓病人的痛苦，并在对于克罗恩病的研究中起到了奠基性的作用。克罗恩病是炎症性肠病的主要类型之一，早先的研究发现肠道定植菌群中的抗原，尤其是Lachnospiraceae细菌表达的鞭毛蛋白（flagellins），是克罗恩病异样免疫反应中的主导抗原【1】。超过半数的病人血清中有针对这些蛋白的抗体【2】，在外周血中针对这些蛋白的记忆性CD4 T细胞也显著增多【3】，而这一现象与病人的复杂病程显著相关【4】。与短期生存的效应性T细胞不同，记忆性T细胞可以长期存在于体内，一旦再次遇到抗原可以迅速被激活并分化为效应性细胞，因此针对Lachnospiraceae鞭毛蛋白的CD4记忆T细胞被认为是导致克罗恩病复发的储藏库。

近日， Science Immunology发表了Dr. Charles Elson最新研究：CD4 T cell activation and concomitant mTOR metabolic inhibition can ablate microbiota-specific memory cells and prevent colitis。他和他的博士后研究员赵清共同设计了一项新的治疗策略，通过特异性激活这些记忆性CD4 T细胞并同时抑制其代谢来清除此类细胞的储藏库，同时促进特异性调节T细胞（regulatory CD4 T cell）的分化，从而达到预防克罗恩病复发的效果，这一策略在文中被简称为CAMCI（cell activation with concomitant metabolic checkpoint inhibition）。

研究人员在此项研究中使用的代谢抑制药物包括临床批准的雷帕霉素（rapamycin）和二甲双胍（metformin）。雷帕霉素可以抑制调控细胞代谢的mTOR复合体，而二甲双胍的作用在于激活mTOR上游的AMPK激酶，从而抑制mTOR。初始T细胞和记忆T细胞代谢水平很低，但是遇到抗原激活的时候，细胞会急速上调mTOR活性，启动以有氧糖酵解（aerobic glycolysis）为主的代谢来满足细胞分化和增生的巨大能量需求。因此作者假设，在特异性激活鞭毛蛋白反应性初始和记忆T细胞的同时抑制这些细胞的mTOR活性，会导致这些致肠炎性CD4 T细胞凋亡和失能。另一方面，雷帕霉素还可以促进诱导调节性T细胞，达到一箭双雕的效果。

文章中，作者主要使用了CBir1 T cell receptor transgenic老鼠模型来证明此策略的可行性。CBir1 鞭毛蛋白由Lachnospiraceae细菌表达，而CBir1 TCR Tg CD4 T细胞特异性地识别CBir1 鞭毛蛋白中的一个表位（CBir1 p456-475），CBir1 TCR Tg CD4 T细胞向Ragulator敲除小鼠移植可以导致小鼠肠炎。为了特异性刺激这些细胞，并且避免先天免疫系统（innate immune system）的激活，作者首先构造了一种新型短肽（multi-epitope peptide 1, MEP1），这种短肽包含了3个CBir1 p456-475表位重复片段。体外细胞实验证实同时使用这一短肽和雷帕霉素可以抑制CBir1 TCR Tg CD4 T细胞的mTOR活性，导致细胞葡萄糖摄入量下降，最终引起细胞死亡。剩余活细胞中调节性T细胞的比例大幅增加，体内和体外试验证明这些调节性T细胞可以提供抗原特异性和非特异性抑制功能。

接下来，作者通过这一小鼠肠炎模型测试了CAMCI策略。实验表明，当受体Rag1-/-小鼠同时接受了肠外MEP1和雷帕霉素治疗时，肠炎得到了有效的预防。相比于阳性对照，此组小鼠结肠中的效应性CBir1 TCR Tg CD4 T细胞大幅减少。进一步，作者证实了肠道环境会改变lamina propria中CD4 T细胞的代谢，细胞被激活时并不会以有氧糖酵解为主要途径供能，因此解释了为何单独使用雷帕霉素并不能阻止肠炎的发生。

后续的体内实验中作者表明了在初始CD4 T细胞第一次接受抗原识别时应用CAMCI策略可以减少抗原特异性记忆性CD4 T细胞和滤泡辅助T细胞的形成，同时促进调节性CD4 T细胞的生成。而对于已经预存的CBir1鞭毛蛋白特异性记忆性CD4 T细胞，同时使用雷帕霉素和二甲双胍则能达到更好的抑制作用。RNA-seq表明接受CAMCI策略后残留的CBir1 CD4 T细胞在转录水平上与对照组有很大程度的不同，具体表现在促细胞增生基因和促炎症基因的下调，以及促凋亡基因的上调，提示CAMCI策略后残留的CD4 T细胞在接受后续特异性抗原刺激时并不会呈现出正常的细胞增殖反应。

最后，作者通过富集分选以及体外培养克罗恩病人外周血细胞，成功得到足以用于实验的Lachnospiraceae鞭毛蛋白特异性CD4 T细胞，并证实CAMCI策略在人体细胞中同样可以引起靶向细胞凋亡。这一结果为此策略在临床中的应用提供了有力的证据。

然而在实际的临床治疗中，只靶向打击一种鞭毛蛋白特异性CD4 T细胞来预防克罗恩病的复发是远远不够的，病人通常携有针对不同鞭毛蛋白以及其他肠道菌群抗原的特异性CD4 T细胞。此项研究的巧妙之处在于研究者可以根据克罗恩病人的血清抗体反应特异性地构造适用于不同病人的独特短肽（multi-epitope peptide），从而实现精准医疗。通过间歇性的重复给予CAMCI治疗，克罗恩病人体内针对肠道菌群抗原的致病性CD4 记忆T细胞储存库将被逐渐清除；同时刺激病人体内调节性T细胞的生成，最终达到预防克罗恩病复发的目的。另外，随着对其他自身免疫疾病抗原的更深入地研究，这项策略理论上也可以拓展应用于一型糖尿病或多发性硬化症等疾病的治疗。

原文链接：

https://immunology./content/5/54/eabc6373

制版人：十一

 

参考文献

1.M. J. Lodes, Y. Cong, C. O. Elson, R. Mohamath, C. J. Landers, S. R. Targan, M. Fort, R. M. Hershberg, Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. J. Clin. Invest. 113, 1296–1306 (2004).

2.S. R. Targan, C. J. Landers, H. Yang, M. J. Lodes, Y. Cong, K. A. Papadakis, E. Vasiliauskas, C. O. Elson, R. M. Hershberg, Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology 128, 2020–2028 (2005).

3.N. Hegazy, N. R. West, M. J. T. Stubbington, E. Wendt, K. I. M. Suijker, A. Datsi, S. This, C. Danne, S. Campion, S. H. Duncan, B. M. J. Owens, H. H. Uhlig, A. McMichael; Oxford IBD Cohort Investigators, A. Bergthaler, S. A. Teichmann, S. Keshav, F. Powrie, Circulating and tissue-resident CD4  T cells with reactivity to intestinal microbiota are abundant in healthy individuals and function is altered during inflammation. Gastroenterology 153, 1320–1337.e16 (2017).

4.S. Kugathasan, L. A. Denson, T. D. Walters, M.-O. Kim, U. M. Marigorta, M. Schirmer, K. Mondal, C. Liu, A. Griffiths, J. D. Noe, W. V. Crandall, S. Snapper, S. Rabizadeh, J. R. Rosh, J. M. Shapiro, S. Guthery, D. R. Mack, R. Kellermayer, M. D. Kappelman, S. Steiner, D. E. Moulton, D. Keljo, S. Cohen, M. Oliva-Hemker, M. B. Heyman, A. R. Otley, S. S. Baker, J. S. Evans, B. S. Kirschner, A. S. Patel, D. Ziring, B. C. Trapnell, F. A. Sylvester, M. C. Stephens, R. N. Baldassano, J. F. Markowitz, J. Cho, R. J. Xavier, C. Huttenhower, B. J. Aronow, G. Gibson, J. S. Hyams, M. C. Dubinsky, Prediction of complicated disease course for children newly diagnosed with Crohn's disease: A multicentre inception cohort study. Lancet 389, 1710–1718 (2017).