|
你是否遇到新方向的实验课题无从下手？相信每位同学都曾有过相关的经历，细胞君初入重组病毒同样迷茫、无所适从，多希望有个帖子告诉我这个实验怎么做、实验方法如何选择。今天好消息就来了，所谓术业有专攻，闻道有先后，专注重组病毒慢病毒（Lentivirus）、腺病毒(Adenovirus)和腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)制备和应用的细胞君就重组病毒如何选择和初入重组病毒的同学们聊聊，分享自己的经验。 首先要搞清楚是采用病毒还是质粒？那就要清楚质粒在体外细胞应用上的缺陷： 1、瞬时转染。转染结束后一般检测时间节点为48~72h。 2、目的细胞限制。如293T，Hela和HT1080都是高转染效率的细胞，高效率才能帮助我们去检测想要的结果。难以质粒转染的细胞如EMT6细胞，低转染效率检测后不能说明问题。   3、转染试剂毒性。脂质型(liposome)或聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）类转染试剂的毒性相对于磷酸钙法转染已经得到极大降低，但毒性依然存在。   所以考虑到上述质粒缺点不影响且符合实验目的，细胞君首推廉价、操作简单和周期短的质粒。 划重点：为节省重组病毒制备的高成本及验证载体表达框或验证靶点效率等，可以先进行在如工具细胞293T的转染验证！阳性对照和阴性对照一定要带上！！ 分界线>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 接下来我们进行一些简单的问答就能够帮助选择适合实验的重组病毒类型。 首先，细胞实验OR动物实验？ 细胞实验：构建稳转细胞系？ 是请直接选择重组慢病毒。慢病毒相对于其他病毒的优势包括：目的基因可整合至宿主细胞基因组从而长时间稳定表达外源基因、感染多种细胞类型和制备周期短、制备方法简单和成本低。但是慢病毒载体克隆容量最多4kb，所以在构建前一定要考虑目的基因的大小及启动子、抗性基因或标记基因等。 Tip：慢病毒感染非唯一构建稳转细胞系途径，质粒转染亦可实现，前提是高转染效率。  否请选择腺病毒。腺病毒的优势包括: 表达峰度非常高、达到8kb的克隆容量及腺病毒可在提供E1A的293细胞中复制。但常用人类腺病毒5型不能用来悬浮细胞转基因，其中目的细胞表面柯萨奇/腺病毒受体即CAR（Coxsackie/adenovirus receptor）的存在是腺病毒感染的必要环节。 Tip：考虑AAV感染的组织特异性强烈不推荐AAV应用细胞实验。 动物实验？果断选择AAV。其优势包括：AAV病毒粒子体积小，易于扩散；特异性强：多种血清型针对不同的组织；表达时间长：在分裂不旺盛的神经元细胞中可持续表达数月；免疫原性低。但AAV载体允许克隆的容量只有2.8kb。 最后附上更多参考信息：同学们可根据实验目的和实验周期合理选择!  下期将为同学们分享稳转细胞系构建经验！ >>>>>初次发稿，不足之处定多多改进，只为更好分享自己的经验。 |
|
|
