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京港感染论坛 早诊快诊，助力精准防治 作者｜刘 思 单位｜北京大学人民医院 原文链接： https://academic./cid/article/71/Supplement_4/S416/6046215?guestAccessKey=6815ebc0-99ad-4fd5-9007-8c4c22505ec3 ▼ 一、研究背景 下呼吸道感染（LRTIs）是低收入国家最常见的死亡原因，并且肺炎是高收入经济体十大死亡原因中唯一的感染性疾病。多种数据表明，LRTIs在中国也是最严重的公共卫生问题之一。下呼吸道感染包括社区获得性肺炎（CAP），医院获得性肺炎（HAP）和呼吸机相关性肺炎（VAP）。 多种病原体（细菌、真菌、病毒、非典型病原体和寄生虫）可引起下呼吸道感染。临床微生物实验室鉴定LRTIs细菌和真菌的主要方法是培养，但其存在局限性——对于病毒、非典型病原体和寄生虫无法常规鉴定。PCR可以覆盖多种病原体，正在临床实验室中取得立足之地，但仍存在不足——会忽略一些未知的病原体。宏基因组测序（mNGS）可高通量同时鉴定呼吸道标本中的细菌、真菌、病毒、非典型病原体、寄生虫以及新型病原体，弥补了传统微生物检测方法的局限性，并已开始应用于临床。 北京大学人民医院王辉教授团队（第一作者陈宏斌、尹玉瑶）自建了用于LRTIs诊断的微生物mNGS测序和数据分析平台，此研究发表在Clinical Infectious Diseases杂志上。作者收集了2019年162例患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样品，通过比较mNGS的结果、联合微生物学检测和综合参考标准，验证了BALF mNGS在LRTIs中的效能。同时，研究并分析了来自感染和未感染组，细菌和病毒感染组以及结核和非结核感染组的宿主转录组，以发现LRTIs、病毒LRTIs和肺结核的标志物。 ▼ 二、研究方法 研究综合多项标准，依次纳入了在2019年2月至2019年9月期间访问北京大学人民医院的162例患者，收集其肺泡灌洗液样本，进行传统的微生物学检测和mNGS以确定病原体，并对在2019年7月至9月之间收集的59例BALF样本进行了宏基因组RNA-seq以鉴定RNA病毒，最后进行宿主基因表达分析和统计分析。 01 患者入组标准 发热、咳嗽、咳痰、呼吸急促、呼吸困难和影像学异常。对162例患者的人口统计学和基线特征、临床表现、影像学和实验室检查、治疗和结局进行了调查，以进行临床诊断。LRTIs的诊断基于复合参考标准，包括所有微生物学检测和临床判断、参考CAP和HAP的诊断标准。该研究已获得北京大学人民医院伦理审查委员会的批准（批准文号：2019PHB134）。 02 mNGS测序和分析流程 用于mNGS DNA-seq的样本进行去宿主核酸后进行测序，采用Illumina NextSeq 550进行150bp双端测序。从NCBI下载了1个人（hg38）、185630个细菌、308个古细菌、54个真菌、9021个病毒、178个无脊椎动物和39个原生动物参考基因组构建比对数据库。每个样本产生大约20M reads。病毒阳性检测（DNA或RNA病毒）定义为测序reads覆盖基因组上的3个或更多非重叠区域。我们对mNGS检测到的病原在Pubmed里进行检索，以确定它们是否引起了肺炎。排除了不会引起肺炎的微生物，包括棒状杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、奈瑟氏菌属和厌氧菌（吸入性肺炎除外）。排除呼吸道的正常菌群后，将细菌、真菌或寄生虫的阳性检出阈值设置为特定物种RPM比率为10或更高，其中RPM比率= RPM（BALF样品）/ RPM （阴性对照），或者如果RPM（阴性对照）= 0，则RPM比率= RPM（BALF样本）。通过比较LRTIs和non-LRTIs组中的RPM比率并基于ROC曲线，确定了15种常见病原体的RPM比率阈值。 03 宿主基因表达分析 将BALF样品RNA-seq reads与人参考基因组hg38进行比对。然后，计算样本中每个基因的FPKM并进行GO功能富集分析。 ▼ 三、主要结果 01 患者特征 在162例患者中，有93例LRTIs和69例非LRTIs，其临床特征有所不同。LRTIs组有基础疾病患者比率显著高于非LRTIs组。但是，非LRITs组的恶性肿瘤尤其是肺癌的发生率明显高于LRTIs组，而LRTI组的血液系统疾病的发生率明显高于非LRTIs组。LRTIs组的住院时间明显长于非LRITs组。LRTIs组的抗生素使用率和白细胞计数显著高于非LRTIs组。两组之间的淋巴细胞百分比也显著不同。LRTIs组的炎症指标C反应蛋白和降钙素原显著高于非LRTIs组（Table 1 & 2）。 Table 1. Demographic and Baseline Characteristics of Patients Table 2. Laboratory Findings of Patients 02 支气管肺泡灌洗液mNGS的诊断性能 1、BALF mNGS在LRTIs病原体鉴定中的临床实用性高于其他方法。在93例LRTIs病例中，通过BALF培养仅检测到19例（20％），结合其他微生物学检测可发现33例（35％），但BALF mNGS检测出多达60例（65％）明确的(definite)或很可能的(probable)病原体。在69例非LRTIs中，有66例（96％）未通过任何微生物学检测，而51例（74％）未通过BALF mNGS检测(Figure 1)。因此，mNGS作为一种新型工具，可大大提高LRTIs的病因诊断。相比较non-LRTIs组患者，LRTIs患者有更高的微生物DNA丰度。 Figure 1. Clinical usability of mNGS for LRTI pathogen identification. A, Proportion of subjects with pathogens that were identified by the different methods. B, Distribution of microbial DNA abundances in patients with and without LRTI. C, Distribution of DNA abundances of definite, probable, possible, and unlikely pathogens. D, Distribution of DNA abundances of the top 15 differential pathogens between patients with and without LRTI. 2、BALF mNGS结果与BALF培养结果、所有微生物学检测结果和临床标准的一致性分别为50.0％、54.9％和70.4％。以综合参考方法为金标准，我们的自建微生物BALF mNGS平台敏感性为66.7％，特异性为75.4％，阳性预测值为78.5％，阴性预测值为62.7％（Table 3）。 Table 3. Positive and Negative Agreement of Microbial Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Metagenomic Next-generation Sequencing Versus BALF Culture, All Microbiological Tests, and Composite Reference Standard. 3、与传统的培养方法相比，mNGS可检测到更多的病毒（13%）和真菌（6%）。在162个BALF样本中，通过培养可得到25种病原体，其中大多数是细菌（92％），仅在2个样本中检测到了烟曲霉（8％），而BALF样本mNGS鉴定出240种病原体，其中细菌占81％，并且，mNGS检测到的病原体谱要比培养方法要广得多（Figure 2）。但是，使用GeneXpert TB PCR试剂盒检测到5例结核分枝杆菌病例，而mNGS仅检测到其中1例。 Figure 2. Comparison of BALF culture and mNGS identification in terms of pathogen detection spectrum. A, Comparison of culture and mNGS identification in terms of pathogen classification categories. B, Comparison of culture and mNGS identification in terms of pathogen species. Different colors indicate different species, and light orange indicates new species detected by mNGS. 03 病毒检测 在59 例同时进行DNA和RNA测序的BALF标本中，30份样本检出病毒，其中有4例检测出RNA病毒，包括3个3型人副流感病毒和1个人冠状病毒OC43。 04 基于宿主反应的下呼吸道感染预测 LRTIs与非LRTIs的患者具有不同的全身炎症反应模式。根据临床诊断、传统微生物学检测和mNGS结果，以及BALF转录组覆盖的人类基因组完整性，选择样本用于LRTIs和非LRTIs组、细菌和病毒感染组、结核和非结核组的比较转录组分析，均存在差异表达基因（DEGs）。在对LRTIs和非LRTIs组的对比中，确定了42个DEGs，与LRTIs有关的包括TRAV32、MIR4270、MHC-II、HLA-DRB1、PSME2、GAPDH；在对细菌和病毒感染组的对比中，确定了246个DEGs，GO富集分析显示大部分DEGs与病毒转录、INF-γ应答、白细胞迁移、吞噬作用、抗原处理和呈递有关。在结核和非结核组的对比中，确定了24个DEGs，其中与LRTIs有关的有PRF1和TRBV9（Figure 3）。 Figure 3. GO enrichment analysis of significantly DEGs. A, LRTIs versus non-LRTIs. B, Bacterial LRTIs versus viral LRTIs. C, Tuberculosis versus nontuberculosis. ▼ 四、局限性 1、患者选择不随机且样本量相对较小。 2、收集BALF样品总是在抗生素治疗之后，这可能影响了细菌和真菌的培养但不影响mNGS的检测，从而导致后者有更高的灵敏度。 3、由于该研究的样本量相对较小且具有初步性质，因此在本研究中确定的LRTIs诊断中的候选生物标志物需要在大规模研究中进一步验证。 ▼ 五、研究意义 1、研究证实了mNGS在LRTIs病原体检测中具有一定优势。mNGS可以检测出培养困难的病原体，一定程度上弥补了传统培养方法的缺点。与传统的培养相比，mNGS可检测到更多的病毒和真菌，并且mNGS检测到的病原体谱要比培养方法要广得多，这有利于对患者的病因学诊断和靶向治疗。 2、自建宏基因组测序平台具有较高的临床效用。mNGS识别出的致病菌种类多且时间短（仅需2天时间），这表明mNGS的应用有益于LRTIs的抗菌管理，例如，若未发现细菌病原体则停止使用抗生素，可以减少抗菌药物的滥用。 3、研究发现BALF mNGS对曲霉属的敏感性高于病理检测和微生物培养。 4、指出mNGS的存在的局限性及优化措施：①诊断结核敏感度低，可通过优化DNA提取过程、富集DNA提高其敏感度；②易受污染，可通过严格无菌操作、设置阴性对照、通过生物信息学分析进行排除来降低污染；③价格高昂。 5、前景展望：①涉及LRTI的5个DEGs（HLA-DRB1、TRAV32、MIR4270、PSME2、GAPDH）与感染相关的免疫应答有关，而这些基因是否可以作为预测LRTIs的标志物，还需要进一步研究。②一些基因在细菌和病毒感染组之间差异显著表达了参与白细胞迁移、对病毒转录和对IFN-γ的反应、白细胞迁移、吞噬作用以及抗原加工和呈递的差异，其是否可作为区分细菌和病毒LRTIs的标志物需要进一步研究。 该项研究发表在Clinical Infectious Diseases杂志。 END 作者｜刘 思 单位｜北京大学人民医院 审核｜陈宏斌 本文转载自“京港感染论坛”公众号 |
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